蛋白–配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及其相互作用分子機(jī)制的虛擬仿真實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的建設(shè)與教學(xué)實(shí)踐
——COVID-19肺炎疫情防控時(shí)期線上教學(xué)的案例

萬(wàn)堅(jiān)，任彥亮，饒立，魏林，李永健，鄧陽(yáng)，孟祥高，原弘

華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430079

結(jié)構(gòu)化學(xué)是在原子、分子的水平上研究微觀物質(zhì)運(yùn)動(dòng)規(guī)律，微觀物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及其與化學(xué)性質(zhì)之間關(guān)系的科學(xué)，是化學(xué)學(xué)科的理論基礎(chǔ)。為了讓學(xué)生更好地學(xué)習(xí)和掌握結(jié)構(gòu)化學(xué)相關(guān)知識(shí)，我們構(gòu)建了模塊化、功能化的“結(jié)構(gòu)化學(xué)課程群”[1]，包括結(jié)構(gòu)化學(xué)、分子模擬基礎(chǔ)、理論與計(jì)算化學(xué)課程，進(jìn)行分類(lèi)分層教學(xué)，以滿(mǎn)足學(xué)生個(gè)性化發(fā)展需求[2]。由于該課程群所涉知識(shí)大多抽象、理論性強(qiáng)、數(shù)理要求高，學(xué)生在學(xué)習(xí)過(guò)程中會(huì)遇到相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。為提高學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，幫助學(xué)生掌握化學(xué)學(xué)科的理論基礎(chǔ)、學(xué)科思維、學(xué)科表達(dá)和學(xué)科應(yīng)用，全面培養(yǎng)學(xué)生終身發(fā)展所需的學(xué)習(xí)力、思考力和發(fā)展力，在長(zhǎng)期的教學(xué)實(shí)踐中，我們逐步構(gòu)建、完善并實(shí)施了基于現(xiàn)代教學(xué)理念和理論的“四輪驅(qū)動(dòng)”教學(xué)策略和方法，如圖1所示。

圖1 本虛擬仿真實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在結(jié)構(gòu)化學(xué)課程群教學(xué)中的定位與作用示意圖

該教學(xué)策略方法包括由點(diǎn)到面的知識(shí)框架圖(Schema)的系統(tǒng)凝練；充分體現(xiàn)“數(shù)-形結(jié)合”能力與素養(yǎng)，且由淺入深的挑戰(zhàn)性問(wèn)題(Challenge Question, CQ)的探索解決；問(wèn)題導(dǎo)向、基于課程項(xiàng)目、注重過(guò)程評(píng)價(jià)的“深度”教學(xué)實(shí)踐(Problem Oriented，Project-Based, Process-Evaluated Teaching and Learning，P3OBE)的分組實(shí)施；以及通過(guò)學(xué)習(xí)者充分準(zhǔn)備和參與的口頭報(bào)告與研討(Oral presentation and discussion)環(huán)節(jié)，完成上述幾類(lèi)“深度”學(xué)習(xí)任務(wù)，自我完善后以“微課”總結(jié)提交最終學(xué)習(xí)“成果”的綜合訓(xùn)練?！暗鞍专C配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及其相互作用分子機(jī)制”的虛擬仿真(Virtual Simulation，VS)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是“結(jié)構(gòu)化學(xué)課程群”理論教學(xué)的實(shí)踐和應(yīng)用，既是P3OBE由淺入深、不可或缺的重要組成部分，亦是后續(xù)P3OBE進(jìn)入高階訓(xùn)練的線上仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)的入門(mén)環(huán)節(jié)(圖2)，充分體現(xiàn)了“能實(shí)不虛，虛實(shí)結(jié)合，虛為實(shí)用”的虛擬仿真實(shí)驗(yàn)三原則。虛似仿真實(shí)驗(yàn)網(wǎng)址：http：//www.ilabx.com/details/v5?id=4299&isView=true。

圖2 “雙輪驅(qū)動(dòng)”的蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象精確預(yù)測(cè)的P3OBE實(shí)踐學(xué)習(xí)框架圖

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象是生物體系分子識(shí)別、生理生化性質(zhì)與功能的分子機(jī)理、基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)等研究領(lǐng)域中的一個(gè)最基本，同時(shí)也是最重要、最復(fù)雜的關(guān)鍵科技問(wèn)題。對(duì)蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象的研究與結(jié)構(gòu)化學(xué)課程群強(qiáng)調(diào)的“宇內(nèi)萬(wàn)物由物質(zhì)組成，相互作用決定其結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)決定其性質(zhì)與功能”的學(xué)科思想高度契合。蛋白環(huán)境及其相互作用決定了蛋白–配體的結(jié)合構(gòu)象及其結(jié)合能力強(qiáng)弱，而蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象和結(jié)合能力又決定了該配體的生物活性的大小。目前獲得蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象最可靠的實(shí)驗(yàn)方法是X射線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析，為此本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括了：X射線衍射法測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)的基本原理以及晶體學(xué)的相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)；蛋白質(zhì)和配體小分子相互作用的主要類(lèi)型和特征，蛋白–配體復(fù)合物的主要功能——催化與抑制催化的機(jī)理。受制于蛋白質(zhì)的復(fù)雜性(分子量大、純化表達(dá)困難、晶體培養(yǎng)條件苛刻、晶體分辨率低等)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段解析蛋白質(zhì)及其配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息往往成本高、難度大。運(yùn)用現(xiàn)代分子模擬方法對(duì)蛋白–配體的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行理論計(jì)算預(yù)測(cè)無(wú)疑是對(duì)上述實(shí)驗(yàn)方法的一個(gè)有益、重要且必須的補(bǔ)充，同時(shí)也是結(jié)構(gòu)化學(xué)研究中的重難點(diǎn)內(nèi)容。因此，學(xué)習(xí)和掌握蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象理論計(jì)算的基本原理和步驟是本虛擬仿真實(shí)驗(yàn)的第三個(gè)研究?jī)?nèi)容。目前應(yīng)用最廣泛的蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象計(jì)算方法是分子對(duì)接，該方法速度快但準(zhǔn)確性不高，這是由于分子對(duì)接在計(jì)算時(shí)為了節(jié)省計(jì)算量而忽略了電子效應(yīng)。我們通過(guò)引入量子力學(xué)計(jì)算發(fā)展了DOX方法[3,4]，顯著地提高了蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象計(jì)算的準(zhǔn)確性。所以，本虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)亦是我們相關(guān)科研成果的轉(zhuǎn)化。在本實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生將同時(shí)體驗(yàn)和比較X射線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析、分子對(duì)接和DOX，深入理解“微觀物質(zhì)結(jié)構(gòu)由微觀物質(zhì)運(yùn)動(dòng)法則即量子力學(xué)決定，而微觀物質(zhì)結(jié)構(gòu)又決定其在宏觀世界的功能”這一結(jié)構(gòu)化學(xué)基本理念，并強(qiáng)化對(duì)學(xué)科知識(shí)和學(xué)科應(yīng)用的掌握。同時(shí)，通過(guò)上述虛擬仿真實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的探究學(xué)習(xí)也為“結(jié)構(gòu)化學(xué)課程群”后續(xù)系統(tǒng)的 P3OBE實(shí)踐打下較為堅(jiān)實(shí)的知識(shí)與方法應(yīng)用的前期基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析

1912年，Laue將一束X射線穿過(guò)硫酸銅晶體，成功地觀察到了X射線衍射圖像。該實(shí)驗(yàn)解決了兩個(gè)爭(zhēng)論已久的問(wèn)題：首先證明X射線是波長(zhǎng)很短的波，其次證明晶體是原子有規(guī)則排列而成的固體。該實(shí)驗(yàn)揭開(kāi)了通過(guò)X射線衍射測(cè)量晶體結(jié)構(gòu)的序幕，基于此貢獻(xiàn)，Laue在1914年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。隨后Bragg父子在Laue的基礎(chǔ)上給出了晶體結(jié)構(gòu)與衍射方向之間的定量關(guān)系，奠定了X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)，這就是著名的Bragg方程：2dsinθ=nλ，式中d是晶體中的晶面間距，θ是入射X射線與晶面的夾角，λ是X射線的波長(zhǎng)。上述公式表明，當(dāng)n為正整數(shù)時(shí)，若等號(hào)成立，即可觀察到疊加而成的衍射光。因此，當(dāng)觀察到衍射光時(shí)，可根據(jù)該夾角和入射光的波長(zhǎng)計(jì)算出晶面間距，獲得晶胞的大小和形狀。此外，衍射強(qiáng)度決定了各原子在晶胞中的位置，通過(guò)測(cè)量X射線穿過(guò)晶體時(shí)產(chǎn)生衍射光的衍射方向和強(qiáng)度，可以推算出晶體的微觀結(jié)構(gòu)，這就是X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析。

2.2 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析

1958年，英國(guó)科學(xué)家John Kendrew和Max Perutz最先發(fā)表了用X射線衍射得到的高分辨率肌紅蛋白Myoglobin的三維結(jié)構(gòu)[5]，開(kāi)創(chuàng)了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析技術(shù)。兩位科學(xué)家也因此獲得了1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的基本流程是，首先通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得大量用于結(jié)晶的高純度目的蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)與預(yù)先配好的結(jié)晶溶液進(jìn)行混合，利用懸滴法獲得蛋白質(zhì)晶體。懸滴法結(jié)晶的基本原理是通過(guò)蒸發(fā)降低蛋白質(zhì)溶液中水含量，使得蛋白質(zhì)結(jié)晶析出。結(jié)晶溶液中主要包括緩沖溶液、沉淀劑、離子鹽。其中，緩沖溶液的作用是保持整個(gè)體系的pH穩(wěn)定；沉淀劑的作用是使得體系的水含量降低，促使蛋白質(zhì)結(jié)晶析出；離子鹽主要用于中和蛋白表面的電荷，增加蛋白之間碰撞堆積的概率。蛋白質(zhì)通過(guò)懸滴法生長(zhǎng)2–30天達(dá)到一定尺寸后，便可撈出放入液氮中保存，送往X射線光源進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)。值得一提的是，蛋白質(zhì)雖然是大分子，但晶體尺寸往往十分小。因此蛋白質(zhì)晶體中結(jié)構(gòu)基元總數(shù)較少，衍射光較弱。為獲得高精度的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，則需要使用強(qiáng)度極高的 X射線。同步輻射光源通過(guò)令高速運(yùn)動(dòng)的電子在磁場(chǎng)中作曲線運(yùn)動(dòng)來(lái)產(chǎn)生高強(qiáng)度 X射線，是進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體衍射實(shí)驗(yàn)的理想光源。目前我國(guó)已建成的同步輻射光源中最先進(jìn)的是上海同步輻射光源。

2.3 蛋白–配體相互作用

配體是指各類(lèi)能和蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子，包括金屬離子、輔因子、底物、抑制劑或激動(dòng)劑分子等。它與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用主要來(lái)自于蛋白質(zhì)原子與配體原子之間形成的氫鍵、離子鍵、靜電作用和疏水作用，有時(shí)也包括共價(jià)鍵。蛋白–配體相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的功能起著至關(guān)重要的作用，例如酶蛋白催化反應(yīng)的本質(zhì)是酶蛋白通過(guò)與底物分子的相互作用促使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。若用另一小分子代替底物與酶蛋白結(jié)合，便可阻斷蛋白-底物相互作用，起到抑制酶蛋白活性的作用，這就是抑制劑的原理。而抑制劑是當(dāng)前創(chuàng)新藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)中的人體 HMG-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，以下簡(jiǎn)稱(chēng)HMGR)[6]為例，HMGR在人體中負(fù)責(zé)催化從3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)到甲羥戊酸(MVA)的合成反應(yīng)，這一反應(yīng)恰好是肝細(xì)胞合成膽固醇過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。因此，抑制HMGR酶蛋白的活性可降低體內(nèi)膽固醇，從而治療高血脂及相關(guān)疾病，著名的他汀類(lèi)降血脂藥物，如明星藥美伐他汀(Mevastatin)和洛伐他汀(Lovastatin)等，均屬于HMGR抑制劑。

2.4 蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象的計(jì)算

準(zhǔn)確解析生物大分子-配體相互作用的三維空間結(jié)構(gòu)(結(jié)合構(gòu)象)是生物體系分子識(shí)別、生理生化性質(zhì)與功能的分子機(jī)理、基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)等研究領(lǐng)域中的一個(gè)最基本同時(shí)也是最重要、最復(fù)雜的關(guān)鍵科技問(wèn)題。目前該領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)方法主要有晶體 X射線衍射法、高分辨液相核磁共振法(NMR)，以及近幾年逐漸受到關(guān)注的冷凍電鏡技術(shù)。然而受制于生物大分子的復(fù)雜性(分子量大、蛋白純化表達(dá)困難、晶體培養(yǎng)條件苛刻、晶體分辨率低等)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段快速解析蛋白質(zhì)等生物大分子及其配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息的方式仍然受到限制和挑戰(zhàn)。運(yùn)用現(xiàn)代分子模擬方法對(duì)生物大分子-配體的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行理論預(yù)測(cè)無(wú)疑是對(duì)上述實(shí)驗(yàn)方法的一個(gè)有益、重要且必須的補(bǔ)充，同時(shí)也是理論與計(jì)算化學(xué)復(fù)雜體系與方法研究中的重要內(nèi)容。理論計(jì)算研究生物大分子中配體分子基態(tài)和激發(fā)態(tài)的性質(zhì)與功能的前提就是要獲得準(zhǔn)確的生物大分子與配體分子的結(jié)合構(gòu)象。因此，在沒(méi)有蛋白復(fù)合物晶體或高分辨 NMR等實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下，發(fā)展復(fù)雜生物體系的理論計(jì)算策略與方法以獲得準(zhǔn)確的生物大分子與配體的結(jié)合構(gòu)象成為該研究領(lǐng)域首先需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

2.4.1 傳統(tǒng)蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象計(jì)算方法：分子對(duì)接

目前應(yīng)用最廣泛的蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象計(jì)算工具是分子對(duì)接。分子對(duì)接是通過(guò)研究配體(如藥物小分子)和受體(如蛋白質(zhì)或其他生物大分子)間相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。它是依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”(lock and key principle)模擬小分子配體與受體生物大分子間的相互作用的，這種相互作用主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。

分子對(duì)接首先產(chǎn)生一個(gè)填充受體分子表面口袋或凹槽的球集，然后生成一系列假定的結(jié)合位點(diǎn)。依據(jù)受體表面的這些結(jié)合點(diǎn)與配體分子的距離匹配原則，將配體分子投映到受體分子表面，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)和扭動(dòng)配體分子得到一組可能的受體-配體結(jié)合構(gòu)象。之后，計(jì)算這些結(jié)合構(gòu)象的親和力，并對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行打分，按得分高低判定最優(yōu)受體配體結(jié)合構(gòu)象并基于該構(gòu)象給出對(duì)配體與受體的結(jié)合能力的計(jì)算。分子對(duì)接的種類(lèi)主要包括：(1) 剛性對(duì)接：在對(duì)接過(guò)程中，研究體系(受體和配體)的構(gòu)象不發(fā)生變化。適合考察比較大的體系，如蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和核酸之間的對(duì)接。(2) 半柔性對(duì)接：指在對(duì)接過(guò)程中，研究體系尤其是配體的構(gòu)象允許在一定的范圍內(nèi)變化。適合處理大分子和小分子間的對(duì)接，且在對(duì)接過(guò)程中，小分子的構(gòu)象一般是可以變化的，但大分子是剛性的。(3) 柔性對(duì)接：指在對(duì)接過(guò)程中，研究體系的構(gòu)象基本上可以自由變化。一般用于需要精確考慮分子間識(shí)別的情況。但是由于計(jì)算過(guò)程中體系的構(gòu)象可以變化，所以柔性對(duì)接計(jì)算耗費(fèi)最大。目前應(yīng)用最廣泛的是半柔性分子對(duì)接計(jì)算。

2.4.2 高精度蛋白–配體結(jié)合構(gòu)象預(yù)測(cè)策略與計(jì)算方法：CSAMP-Strategy Based DOX Method

目前傳統(tǒng)分子對(duì)接計(jì)算方法獲廣泛應(yīng)用，它的優(yōu)點(diǎn)是計(jì)算速度快，但同時(shí)也有計(jì)算精度不高的問(wèn)題。根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)七種主流分子對(duì)接程序的系統(tǒng)評(píng)測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)，以預(yù)測(cè)/正確構(gòu)象差異RMSD ＜0.2 nm為標(biāo)準(zhǔn)，不同分子對(duì)接方法的準(zhǔn)確率大致在30%–60%，盡管RMSD ＜ 0.2 nm的標(biāo)準(zhǔn)并不算嚴(yán)格。

文獻(xiàn)報(bào)道還發(fā)現(xiàn)分子對(duì)接搜索構(gòu)象的效率較高，在所產(chǎn)生的全部結(jié)合構(gòu)象中往往已包含“正確”結(jié)合構(gòu)象。其預(yù)測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)的根源在于構(gòu)象排序所用的經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)的精度有限。若用更高精度的理論取代經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)對(duì)構(gòu)象進(jìn)行排序，即可提高結(jié)合模式預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度。我們課題組與復(fù)旦大學(xué)徐昕教授合作，基于上述思路發(fā)展了高精度蛋白–配體結(jié)合模式計(jì)算方法DOX。DOX方法的主要特點(diǎn)是利用CSAMP (Conformation Search Across Multiple-Level Potential-Energy Surfaces)策略[3]，將分子對(duì)接、半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)理論和第一性原理密度泛函理論進(jìn)行有機(jī)結(jié)合。所謂CSAMP策略即是用低精度理論進(jìn)行全局構(gòu)象搜索，用中精度理論進(jìn)行構(gòu)象篩選，用高精度理論進(jìn)行構(gòu)象排序。該策略結(jié)合了低精度理論的高效率和高精度理論的準(zhǔn)確性，從而允許我們利用較少的計(jì)算量逼近計(jì)算量無(wú)法估計(jì)的高精度搜索全勢(shì)能面的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)第一性原理級(jí)別的高精度構(gòu)象預(yù)測(cè)。在 DOX方法中，PM7半經(jīng)驗(yàn)方法被用于對(duì) Surflex Dock產(chǎn)生的 300個(gè)構(gòu)象進(jìn)行篩選，取前 10個(gè)用 eXtended ONIOM(XO)計(jì)算進(jìn)行最終排序。XO是徐昕教授課題組開(kāi)發(fā)的復(fù)合計(jì)算化學(xué)理論方法，通過(guò)分塊計(jì)算顯著降低高標(biāo)度理論的計(jì)算量，從而實(shí)現(xiàn)巨大體系的密度泛函理論計(jì)算。

在Astex標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試集上的測(cè)試結(jié)果表明DOX方法的結(jié)合模式計(jì)算準(zhǔn)確率(以RMSD ＜ 0.2 nm為標(biāo)準(zhǔn))高達(dá)99%，顯著優(yōu)于分子對(duì)接的表現(xiàn)。采用更嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)(RMSD ＜ 0.1nm)，DOX方法的準(zhǔn)確率仍可達(dá)到70%以上，這意味著DOX計(jì)算的精度已接近晶體結(jié)構(gòu)。需要說(shuō)明的是，DOX1.0方法已于2016年發(fā)表[4]，DOX2.0方法于2019年發(fā)表[3]。目前可通過(guò)訪問(wèn)DOX網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器進(jìn)行計(jì)算服務(wù)(http：//202.114.32.71：10280/wandox/ DOXserver/home.html)。

3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟要求

3.1 實(shí)驗(yàn)方法描述

原子、分子等微觀結(jié)構(gòu)的相互作用是化學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心，但宏觀世界和微觀世界的尺度鴻溝令我們的肉眼無(wú)法直接觀察到這些微觀結(jié)構(gòu)，這也為學(xué)生學(xué)習(xí)和理解相關(guān)知識(shí)設(shè)下了障礙。本實(shí)驗(yàn)將利用虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)，以肺炎鏈球菌3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMGR)和當(dāng)前世界上使用最廣泛的明星降血脂藥-美伐他汀為例，全面、真實(shí)、細(xì)致地讓學(xué)生了解微觀結(jié)構(gòu)的獲取方法，掌握分析研究酶蛋白與抑制劑相互作用的不同手段，從而使學(xué)生能以直觀的方式觀察微觀結(jié)構(gòu)，學(xué)習(xí)微觀世界。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)模塊：模塊一為 X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)；模塊二為蛋白–底物相互作用分析和操作模塊；模塊三為蛋白-抑制劑相互作用分析模塊。在本實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生首先學(xué)習(xí)如何將美伐他汀對(duì)接到HMGR底物活性空腔中，再運(yùn)用3D互動(dòng)功能尋找在分子對(duì)接計(jì)算級(jí)別下打分最高的美伐他汀結(jié)合構(gòu)象與HMGR形成的氫鍵數(shù)量。但是與晶體的美伐他汀與HMGR形成的氫鍵相比，分子對(duì)接中打分最高構(gòu)象與HMGR的相互作用中少了一根氫鍵，分子對(duì)接結(jié)果不夠準(zhǔn)確。為此，學(xué)生需要進(jìn)一步學(xué)習(xí)運(yùn)用最新改進(jìn)的高精度DOX方法，對(duì)抑制劑在酶蛋白中的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行深度優(yōu)化，最終通過(guò)UNIT的3D互動(dòng)功能，學(xué)生可以發(fā)現(xiàn)影響抑制劑的抑制活性的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵藥效團(tuán)明顯增加，并與晶體結(jié)構(gòu)相比非常吻合。課后教師根據(jù)軟件操作的情況，結(jié)合學(xué)生撰寫(xiě)的“實(shí)驗(yàn)分析報(bào)告”進(jìn)行綜合評(píng)分。

3.2 學(xué)生操作步驟

3.2.1 X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)(模塊一)

衍射基礎(chǔ)知識(shí)學(xué)習(xí)：學(xué)生可點(diǎn)擊“X射線衍射基礎(chǔ)知識(shí)”，觀看解說(shuō)動(dòng)畫(huà)，學(xué)習(xí)X射線衍射法測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)的基本原理。晶體樣品放置：學(xué)習(xí)完射線衍射法測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)的基本原理后，學(xué)生可點(diǎn)擊“X射線單晶衍射虛擬實(shí)驗(yàn)(示范)”，以CsCl晶體的X射線衍射實(shí)驗(yàn)為例，學(xué)習(xí)如何在顯微鏡中觀察晶體。之后將CsCl晶體放置于X射線衍射儀上，學(xué)習(xí)調(diào)整晶體位置(圖3A)、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)(圖3B)、用CCD拍攝衍射光(圖3C, D)等基本操作。

圖3 X射線衍射儀上晶體的放置、調(diào)整、旋轉(zhuǎn)及衍射光拍攝等仿真實(shí)驗(yàn)圖

衍射結(jié)果處理：通過(guò)X射線衍射可得到晶胞的形狀、各原子的相對(duì)位置及相對(duì)衍射強(qiáng)度。之后根據(jù)上述信息進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析，包括通過(guò)晶胞的形狀確定晶系和點(diǎn)陣形式，根據(jù)原子相對(duì)位置確定其分?jǐn)?shù)坐標(biāo)，根據(jù)衍射強(qiáng)度歸屬元素符號(hào)。在示范實(shí)驗(yàn)中(圖4A)，每一步均有詳細(xì)介紹，操作錯(cuò)誤會(huì)收到提示(圖4B)。生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告：點(diǎn)擊模塊一的“實(shí)驗(yàn)報(bào)告在線填寫(xiě)”，將會(huì)生成該模塊的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理以及學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的各項(xiàng)操作的錯(cuò)誤數(shù)和打分情況，具體如圖4(C,D)所示。對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟糠郑覀儗⒃谡n堂上會(huì)組織學(xué)生進(jìn)行口頭報(bào)告和分組討論。

圖4 晶胞中各原子的相對(duì)位置和相對(duì)衍射強(qiáng)度的虛擬仿真操作及模塊一的實(shí)驗(yàn)報(bào)告情況分析

3.2.2 蛋白–底物相互作用分析(模塊二)

蛋白晶體衍射知識(shí)學(xué)習(xí)。學(xué)生可以點(diǎn)擊“蛋白質(zhì)X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析”觀看動(dòng)畫(huà)，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析方法。配催化反應(yīng)知識(shí)學(xué)習(xí)：HMGR/HMG-CoA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與機(jī)理。蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的作用無(wú)可替代，這也決定了對(duì)其性質(zhì)、機(jī)理和功能的研究需要建立在其三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上。前述X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析法正是獲取蛋白質(zhì)精細(xì)三維結(jié)構(gòu)的主要途徑。根據(jù)X射線獲得的蛋白–配體復(fù)合物精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，學(xué)生將會(huì)發(fā)現(xiàn)和學(xué)習(xí)底物(HMGR-CoA)和輔因子在蛋白質(zhì)(HMGR)活性空腔中進(jìn)行催化反應(yīng)的機(jī)制和原理。在學(xué)習(xí)中，學(xué)生開(kāi)始認(rèn)識(shí)到“酶催化反應(yīng)的效率是由酶蛋白活性空腔中的關(guān)鍵氨基酸殘基(藥效團(tuán))來(lái)決定”，發(fā)現(xiàn)了蛋白–底物的相互作用主要是配體與藥效團(tuán)形成氫鍵作用，并掌握了決定酶HMGR催化反應(yīng)效率的關(guān)鍵藥效團(tuán)。

3.2.3 蛋白–抑制劑相互作用分析(模塊三)

分子對(duì)接原理的學(xué)習(xí)：在學(xué)習(xí)了影響底物催化反應(yīng)機(jī)理關(guān)鍵藥效團(tuán)后，學(xué)生將在該模塊中使用目前最流行的藥物設(shè)計(jì)方法——分子對(duì)接進(jìn)行HMGR抑制劑的設(shè)計(jì)。首先在“分子對(duì)接與DOX計(jì)算”子模塊中，學(xué)生可以理論學(xué)習(xí)分子對(duì)接和DOX計(jì)算的基本原理。分子對(duì)接設(shè)計(jì)HMGR抑制劑：點(diǎn)擊“分子對(duì)接獲取 HMGR/美伐他汀的結(jié)合模式”，學(xué)生開(kāi)始嘗試將降血脂藥美伐他汀對(duì)接到HMGR酶蛋白中，并選擇HMGR的三維結(jié)構(gòu)。在分子對(duì)接前需要對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理化的優(yōu)化處理，點(diǎn)擊“蛋白刪除水分子”按鈕，刪除蛋白中不參與催化反應(yīng)的水分子，以避免影響分子對(duì)接結(jié)果。X射線衍射無(wú)法正確分析酶蛋白中氫原子的位置，而沒(méi)有氫原子的蛋白是無(wú)法進(jìn)行正確的分子對(duì)接計(jì)算的，因此在對(duì)接前必須要對(duì)沒(méi)有氫的酶蛋白進(jìn)行加氫處理，點(diǎn)擊“蛋白和小分子加氫”對(duì)酶蛋白進(jìn)行合理的加氫操作和處理。抑制劑在蛋白中的結(jié)合模式分析：點(diǎn)擊“提交”按鈕，對(duì)抑制劑和酶蛋白的相互作用結(jié)合構(gòu)象合理性進(jìn)行計(jì)算分析，學(xué)生可尋找美伐他汀在 HMGR酶蛋白中的結(jié)合位置，并結(jié)合前面底物的結(jié)合模式分析美伐他汀是否競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)HMGR底物空腔。此外，還需要從整體視角觀察HMGR酶蛋白活性空腔的形狀，并分析抑制劑小分子與HMGR活性空腔是否形狀匹配。在三維真實(shí)模式中，學(xué)生首先在分子對(duì)接的打分最高構(gòu)象中，尋找美伐他汀與HMGR中的關(guān)鍵藥效團(tuán)能形成的氫鍵，并手動(dòng)選擇，如圖5(A, B)所示。當(dāng)然，學(xué)生也可以點(diǎn)擊晶體中美伐他汀與HMGR中的關(guān)鍵藥效團(tuán)形成的氫鍵情況。通過(guò)兩種結(jié)構(gòu)模式的比較，學(xué)生可以發(fā)現(xiàn)，分子對(duì)接確實(shí)可以還原部分晶體結(jié)合模式，雖然有一個(gè)氫鍵在分子對(duì)接打分最高的構(gòu)象中無(wú)法找到，但其實(shí)存在這樣的結(jié)合模式，只是無(wú)法正確評(píng)價(jià)并打分。

DOX計(jì)算分析HMGR與抑制劑的結(jié)合模式：點(diǎn)擊“DOX計(jì)算獲取HMGR/美伐他汀的結(jié)合模式”，學(xué)生可以采用高精度計(jì)算方法(DOX)優(yōu)化上述結(jié)合模式，如圖5(C, D)所示。之后，觀察計(jì)算所得的新結(jié)合模式，識(shí)別主要的蛋白–抑制劑相互作用。實(shí)驗(yàn)報(bào)告：在每個(gè)模塊完成后，點(diǎn)擊“實(shí)驗(yàn)報(bào)告在線填寫(xiě)”，將會(huì)生成對(duì)應(yīng)模塊的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理以及學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的各項(xiàng)操作的錯(cuò)誤數(shù)和打分情況。對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟糠?，我們將?huì)在課堂上組織學(xué)生口頭報(bào)告和分組討論實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)得分以及心得體會(huì)。

圖5 在HMGR空腔中抑制劑對(duì)接構(gòu)象和晶體構(gòu)象的差異性及DOX計(jì)算過(guò)程的虛擬仿真示意圖

4 結(jié)語(yǔ)

本虛擬仿真實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(軟件著作權(quán)登記號(hào)為：2019SR1073615[7])已經(jīng)在結(jié)構(gòu)化學(xué)、分子模擬基礎(chǔ)以及理論與計(jì)算化學(xué)等課程中針對(duì)我?；瘜W(xué)類(lèi)專(zhuān)業(yè)16和17年級(jí)部分本科生嘗試開(kāi)展了線上虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)服務(wù)。在2020年春季學(xué)期COVID-19肺炎疫情防控期間，響應(yīng)教育部“停課不停學(xué)”的號(hào)召，本項(xiàng)目除了為本校的學(xué)生提供線上自主學(xué)習(xí)服務(wù)之外，也積極面向全國(guó)高校學(xué)生免費(fèi)開(kāi)放使用服務(wù)。目前，國(guó)家虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目共享平臺(tái)上本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目瀏覽量已超過(guò)15,000人，實(shí)驗(yàn)完成人數(shù)超過(guò)500人，起到了很好的線上教學(xué)示范作用。