三種花生根腐病菌間生物學特性及致病力的比較分析

李 瑩，張竹青，王連剛，袁宗英，于建壘，于 靜，張 霞，郭志青，許曼琳，宋新穎，何 康，遲玉成*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.萊西市望城街道辦事處農(nóng)業(yè)服務中心，山東 萊西 266601；3.青島市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，山東 青島 266071； 4.山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100)

花生(Arachishypogaea)是我國重要的油料與經(jīng)濟作物，是食用植物油和蛋白質(zhì)的重要來源，其在國民經(jīng)濟發(fā)展和對外貿(mào)易中占據(jù)著不可或缺的地位。隨著氣候和種植模式的變化，花生病害逐年嚴重，儼然成為花生產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的主要障礙，也是導致花生供不應求的重要原因。

花生根腐病是一種常發(fā)性病害，在生產(chǎn)上是最難以防治的土傳病害之一。鐮孢菌屬(Fusarium)真菌是一類既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌，是使農(nóng)作物致病的重要病原菌[1-2]。在花生的整個生育期均可以進行侵染，播種后出苗前會導致芽和種子腐爛等現(xiàn)象；苗期感染會導致花生苗出現(xiàn)根腐、枯萎等情況；成株期通過破壞花生的維管束組織，影響花生進行正常的水分和營養(yǎng)等物質(zhì)運輸，從而導致根腐、莖腐、莖基腐等嚴重病害[3-4]。鐮孢菌在感染花生后可在植株內(nèi)寄生很長時間并且具有很強的隱蔽性。到發(fā)育后期，開始侵染花生莢果，導致花生品質(zhì)出現(xiàn)下降，更嚴重時會出現(xiàn)籽粒腐爛并且產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對花生產(chǎn)量及品質(zhì)產(chǎn)生極大影響，嚴重時造成減產(chǎn)20%以上[5]。由鐮孢菌引起其他作物根腐病的情況也不乏報道，如大豆根腐病[6]、豇豆根腐病[7]、百合根腐病[8]、黨參根腐病[9]及丹參根腐病[10]等。

對鐮孢菌生長發(fā)育的研究將有助于了解其培養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)過程的異質(zhì)性指標，為進一步研究鐮孢菌的致病機理提供相關依據(jù)[11]，同時，可以加快田間病害的病原菌鑒定。通過對鐮孢菌致病力的差異分析，可有效鑒定強致病力菌株，加以重點防治，減輕花生根腐病的發(fā)生，提高花生的產(chǎn)量及品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)和茄腐鐮孢菌(Fusa-riumsolani)是實驗室采集分離自花生根腐病的病原菌，由實驗室保存。供試品種花育36號。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試PDA、PDB培養(yǎng)基的配制參考方中達的方法[12]。

1.3 試驗方法

1.3.1 鐮孢菌培養(yǎng)與觀察

① 固體培養(yǎng)及形態(tài)學觀察：在PDA培養(yǎng)基上選取生長5 d的供試菌株，在菌落邊緣打取6 mm的菌餅，有菌絲的一面緊貼培養(yǎng)基，分別接種到相應培養(yǎng)基上。25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。觀察并記錄鐮孢菌的顏色、氣生菌絲并拍照。實驗重復3次。

② 液體培養(yǎng)及分生孢子計數(shù)：取直徑6 mm菌餅6個分別接到40 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于25 ℃的搖床中150 r/min培養(yǎng)5 d，使用無菌過濾布進行過濾，去除其中的菌絲和菌餅，得到孢子懸液。經(jīng)4 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入ddH2O重新懸浮，經(jīng)3次離心-懸浮，獲得干凈無雜質(zhì)的孢子懸浮液。在顯微鏡下觀察3種鐮孢菌分生孢子的產(chǎn)生過程，觀察孢子形態(tài)并統(tǒng)計三種鐮孢菌孢子的大小，n=100，實驗重復3次。按照上述方法獲得孢子懸浮液，稀釋100倍后在顯微鏡下使用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量。每次試驗每個菌株設置3個重復，實驗重復3次。

1.3.2 鐮孢菌接種

① 胚軸接種法：挑選大小一致，顆粒飽滿的花生種在蛭石中培育，放置于25 ℃黑暗條件下，種子萌發(fā)至胚軸生長達5 cm左右時，每株花生胚軸上接種一個菌餅，每個鐮孢菌株至少接種6株，置于25 ℃條件下黑暗保濕培養(yǎng)5 d，每天觀察其發(fā)病情況。實驗重復3次。

② 浸根接種法：在溫室中選取大小一致培養(yǎng)7 d的健康花生苗，每5株為一組，置于滅菌的罐頭瓶中，每個罐頭瓶中加入107個/mL濃度的孢子懸浮液200 mL，浸泡花生苗根部，置于25 ℃的搖床上80 r/min培育3 d，每日觀察并記錄花生的發(fā)病情況。實驗重復3次。

③ 土壤接種法：按照上述方法獲得孢子懸液，調(diào)到濃度1×107個/mL。在一次性杯子的1/3底層用滅菌土，中間層用孢子液拌土，上層為滅菌土。將消毒處理后的花生種置于上層滅菌土中，每個一次性杯子種一?；ㄉN，每5株為一個鐮孢菌處理組，設3組鐮孢菌處理，1組對照(不加孢子液)，待植株發(fā)病較為明顯時拍照，重復3次。

2 結果與分析

2.1 鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖1可知，F(xiàn).oxysporum菌落呈圓形，產(chǎn)生很厚的白色氣生菌絲，菌絲致密，在生長過程中邊緣較為不規(guī)則，菌絲背面橙紅色；F.proliferatum菌落呈圓形且中間部分出現(xiàn)氣生菌絲斷層，菌絲顏色由淡黃至灰白，菌落較為致密且邊緣不規(guī)則，菌絲背面中心呈紫紅色，外圍淡黃色；F.solani菌落呈圓形，氣生菌絲較薄且中間部分出現(xiàn)氣生菌絲斷層，菌落質(zhì)地內(nèi)圈較稀疏，外圈致密，邊緣規(guī)則，菌絲背面有明顯的菌絲圈，顏色由內(nèi)到外逐漸變淺。現(xiàn)將這三種鐮孢菌菌絲的形態(tài)特征歸納如表1。

表1 不同鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) Table 1 Colony morphology of Fusarium on the PDA

2.2 產(chǎn)孢過程及孢子形態(tài)

為了解鐮孢菌的產(chǎn)孢過程，在顯微鏡視野中觀察到菌絲分枝的頂端縊縮產(chǎn)生小型分生孢子(圖2)。同時發(fā)現(xiàn)F.oxysporum的小型分生孢子一般無隔、單細胞，孢子大小(3.97～4.66)μm×(2.88～3.62)μm，大型分生孢子鐮刀型，多數(shù)3隔，(12.51～43.68)μm×(2.92～5.05)μm；F.proliferatum的小型分生孢子1～2個隔，孢子大小(6.58～12.63)μm×(2.98～4.78)μm，大型分生孢子舟型，(22.36～45.83)μm×(3.58～5.02)；F.solani的小型分生孢子形態(tài)最大，小型分生孢子大小(8.84～15.60)μm×(2.97～4.94)μm，大型分生孢子鐮刀型，(18.51～44.67)μm×(3.18～6.23)μm。

2.3 產(chǎn)孢量

按照1.3.1 ② 的方法，對三種鐮孢菌進行了產(chǎn)孢量的測定，如圖3所示，孢子含量分別為：(9.11±0.59)×107/mL、(6.68±0.77)×107/mL、(1.68±0.42)×107/mL；結果經(jīng)新復極方差分析，三種鐮孢菌的產(chǎn)孢能力存在極顯著性差異(P<0.01)，且尖孢鐮孢(A)>層出鐮孢(B)>茄腐鐮孢(C)。

2.4 鐮孢菌侵染花生的致病力測定

2.4.1 菌絲塊接種花生胚軸法測定鐮孢菌致病力

圖4所示，菌絲塊接種的花生胚軸上長出白色的菌絲，胚軸變褐且發(fā)病范圍分別為F.oxysporum2.3±0.3 cm、F.proliferatum2.0±0.2 cm、F.solani1.1±0.2 cm。經(jīng)測量統(tǒng)計發(fā)病長度并新復極方差分析，結果表明，三種鐮孢菌的菌絲塊在花生胚軸上的致病力呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01)：尖孢鐮孢(A)>層出鐮孢(AB)>茄腐鐮孢(B)。

2.4.2 孢子液浸根法測定鐮孢菌致病力

如圖5所示，F(xiàn).oxysporum接種的花生苗側根脫落，脫落的側根呈腐爛狀，主根顏色變成褐色；F.proliferatum接種后的花生側根脫落，脫落的側根顏色變褐，但未腐爛，主根顏色變成輕微褐色；花生苗接種F.solani后側根脫落，脫落的側根顏色變褐，但未腐爛，主根顏色輕微褐色，與F.proliferatum接種的變化差異不明顯。對照組花生苗側根完整無脫落，顏色正常。

2.4.3 孢子液拌土培育花生苗法測定鐮孢菌致病力

在前述離體接種分析致病力的基礎上，進一步分析活體上接種以確認是否會呈現(xiàn)相似的致病力結果。按照1.3.2 ③土壤接種法培養(yǎng)20 d后，接種鐮孢菌的花生苗開始出現(xiàn)萎焉的癥狀，再經(jīng)過2～3 d后癥狀明顯加劇，花生苗都表現(xiàn)為葉片和莖枯萎，植株萎蔫；而對照組花生苗長勢良好，葉片新鮮且充滿活力，未現(xiàn)枯萎(圖6)。通過剖析接種鐮孢菌的花生根莖部，發(fā)現(xiàn)維管組織呈現(xiàn)出不同程度的褐變，嚴重程度表現(xiàn)為：尖孢鐮孢>層出鐮孢>茄腐鐮孢。利用李迎賓等制定的三七根腐病分級標準[13]，對三種鐮孢菌侵染花生后的病害進行分級統(tǒng)計，并獲得病情指數(shù)分別為：尖孢鐮孢(84%)>層出鐮孢(76%)>茄腐鐮孢(64%)。

3 討 論

引起植物根腐病的鐮孢菌種類繁多，牛世全等[14]發(fā)現(xiàn)引發(fā)黃芪根腐病的主要致病菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和茄腐鐮孢菌(F.solani)；馬鈴薯根腐病的主要致病菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)及茄腐鐮孢菌 (F.solani)[15-16]；近期報道當歸根腐病的病原菌為燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)和銳頂鐮孢菌 (F.acuminatum)[17]，玉竹根腐病的致病菌為銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)[18]。而對于花生根腐病的病原菌鑒定，實驗室前期只鑒定到鐮孢菌為優(yōu)勢菌群，未進行深入鑒定及分類研究[19]。本研究在已有基礎上得到上述結果，明確了三種鐮孢菌均能致病，并鑒定出優(yōu)勢菌株為尖孢鐮孢菌。

三種接種方式鑒定鐮孢菌致病力的方法存在各自優(yōu)缺點。菌絲塊接種胚軸的方法是最簡便快速的，能有效區(qū)分致病力之間的差別，缺點是菌絲塊接種只能側面反映菌株致病力，對于能夠產(chǎn)生分生孢子的病原菌而言，分生孢子的致病力分析才是最重要的。孢子液浸根接種法是最直接的，孢子直接接觸花生根系，但缺點是致病力差異小的菌株之間不能明顯區(qū)分開，像試驗中層出鐮孢菌和茄腐鐮孢菌呈現(xiàn)的致病力差異不明顯。土壤接種法是最接近田間病害發(fā)生的一種方法，但試驗周期長。因此，分析病原菌致病力需綜合多種方法才更能全面地反映病原菌的致病力。