單核細(xì)胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力及耐藥性分析

張?jiān)俪?/p>

（昌吉州動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆 昌吉 831100）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是人畜共患傳染病李斯特菌病的病原菌，廣泛分布于自然界[1]。李斯特菌病發(fā)病急，發(fā)病率較低，但病死率高，各種年齡、種類的動(dòng)物以及人類均可感染發(fā)病，主要以幼齡動(dòng)物和妊娠母畜較易感[2]。目前，已證實(shí)LM可感染綿羊、山羊、牛、豬、鹿、雞、兔、鼠、鴨、鵝、鸚鵡、北極狐等40多種動(dòng)物。LM 可引起牛、綿羊、山羊以及豬等家畜發(fā)生腦膜腦炎、流產(chǎn)和急性敗血病[3-4]，也可導(dǎo)致禽類敗血癥和心肌壞死的發(fā)生，對(duì)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，LM作為一種重要的食源性細(xì)菌，能夠污染肉、奶、蛋等動(dòng)物性食品，引起食品中毒，導(dǎo)致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發(fā)病，對(duì)人類的健康也構(gòu)成極大的威脅[5-6]。近年來(lái)，李斯特菌病廣泛流行于新疆綿羊群，對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失，通過(guò)動(dòng)物性食品直接威脅人們的身體健康。此外，臨床上濫用抗菌藥物造成耐藥流行株出現(xiàn)，因此，本研究對(duì)LM新疆流行株的毒力、致病性和耐藥性開(kāi)展試驗(yàn)，為科學(xué)防治李斯特菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綿羊肝臟內(nèi)分離得到單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株LM-SB2 和LM-SB5，現(xiàn)由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)小鼠購(gòu)自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器

試劑：BHK液體和固體培養(yǎng)基購(gòu)自湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司；乙醇、二甲苯、石蠟、0.5%～1.0%伊紅乙醇溶液，均購(gòu)自新百特化工公司；蘇木素染液購(gòu)自湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司。

儀器：Pico17離心機(jī)（Thermo公司）、Pico17培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、KD-2260切片機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）、NE910顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）。

1.3 藥敏紙片

選用環(huán)丙沙星、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、阿莫西林、阿奇霉素、克拉霉素、氨芐西林、新生霉素、諾氟沙星、頭孢唑啉、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、氯霉素、鏈霉素、紅霉素共17種藥敏紙片，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：090413。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 LM-SB2和LM-SB5的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

將LM-SB2 和LM-SB5 接種至BHK 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法分別對(duì)LM-SB2 和LM-SB5計(jì)數(shù)，測(cè)得LM-SB2 菌液濃度為4.30×109CFU/mL，LM-SB5菌液濃度為1.43×109CFU/mL。

1.4.2 LM-SB2和LM-SB5的LD50測(cè)定

LM-SB2和LM-SB5菌液分別3 000 r/min離心5 min，純化后，再分別以101、100、10-1、10-2、10-3濃度梯度進(jìn)行稀釋。選擇66只小白鼠，隨機(jī)分為11組，每組6只，其中一組為對(duì)照組；分別將LM-SB2和LM-SB5各梯度濃度菌液腹腔注射至各組小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射量為0.1 mL，對(duì)照組腹腔注射等量的滅菌生理鹽水。接種后采取隔離飼養(yǎng)，1 w 內(nèi)記錄小鼠死亡情況與細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）情況，根據(jù)小鼠死亡數(shù)采用Read-Muench法計(jì)算兩種菌株的LD50。

1.4.3 LM-SB2和LM-SB5藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦K-B瓊脂法進(jìn)行。挑取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的LM-SB2 和LMSB5純培養(yǎng)菌落，懸于3 mL 生理鹽水，混勻后與菌液比濁管比濁。以白紙為背景，調(diào)整濁度與比濁管（0.5 MCF）相同。接種適量菌液均勻涂板，待平板上水分被瓊脂完全吸收后貼紙片，使用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，每個(gè)平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，菌接種后15 min 內(nèi)貼完紙片。將平板反轉(zhuǎn)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后取出，測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS 抗微生物藥物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（紙片擴(kuò)散法）[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM-SB2和LM-SB5的LD50測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表1、表2）

由表1、表2可知，同劑量的菌液，在不同的稀釋度下，造成小鼠的死亡數(shù)不同，接種生理鹽水的對(duì)照組小鼠均未死亡。接種菌株LM-SB2的各組，死亡數(shù)與CPE數(shù)均隨濃度梯度降低而降低，濃度≤10-2時(shí)，死亡數(shù)與CPE數(shù)均為0；接種菌株LM-SB5的各組中，濃度為101時(shí)，該組小鼠全部死亡，且全部發(fā)生細(xì)胞病變。

表1 菌株LM-SB2接種小鼠后死亡、CPE情況Tab.1 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB2

表2 菌株LM-SB5接種小鼠后死亡、CPE情況Tab.2 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB5

根據(jù)小鼠的死亡數(shù)，計(jì)算測(cè)得菌株LM-SB2 和LMSB5的LD50分別為4.30×108.5CFU和1.43×107.5CFU。

2.2 LM-SB2和LM-SB5的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

由表3 可知，LM-SB2 和LM-SB5 對(duì)氨芐西林、青霉素、亞胺培南均耐藥；對(duì)頭孢唑啉、四環(huán)素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、新生霉素均敏感；對(duì)阿莫西林、諾氟沙星均中介。菌株LM-SB2 對(duì)環(huán)丙沙星敏感、對(duì)阿米卡星中介；菌株LM-SB5 對(duì)環(huán)丙沙星中介、對(duì)阿米卡星敏感。

表3 LM-SB2和LM-SB5的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of drug susceptibility test of LM-SB2和LM-SB5

3 討論

李斯特菌病一直是新疆綿羊養(yǎng)殖的潛在威脅。據(jù)調(diào)查，自1995年，新疆石河子、奎屯、伊犁等地區(qū)先后暴發(fā)李斯特菌病，造成大批羔羊死亡[8]。經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病主要發(fā)生在較寒冷地區(qū)及氣溫變化較大的春末與秋末。LM 廣泛分布于自然界，對(duì)低溫、紫外線、酸堿等環(huán)境因素具有較強(qiáng)的抵抗力，是重要的食源性人畜共患病病原[8-9]。不同地區(qū)的LM對(duì)動(dòng)物機(jī)體的致病性存在差異，因此開(kāi)展新疆地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力進(jìn)行測(cè)定以及耐藥性檢測(cè)分析，對(duì)于掌握該病的流行病學(xué)以便采取有效防控措施具有重要意義。

LM的致病性與不同流行株的毒力有關(guān)[10-11]。本試驗(yàn)采用腹腔注射接種的方法人工感染小鼠，測(cè)定兩種LM 毒株的毒力。結(jié)果表明，不同LM 流行株之間的毒力存在差異，菌株LM-SB5 的毒力是菌株LM-SB2 的30 倍，不同流行株之間的毒力差異也可作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)室診斷要點(diǎn)。

近年來(lái)，抗生素廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)，導(dǎo)致各LM菌株表現(xiàn)不同程度的耐藥性，給動(dòng)物性食品的安全性及該病的防治工作造成巨大隱患。國(guó)內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，LM 作為常見(jiàn)食源性細(xì)菌之一，在生肉、奶酪、雞蛋及肉制品等動(dòng)物性食品中均有不同程度的污染，給人們的健康帶來(lái)了極大的威脅[12]。

通過(guò)對(duì)新疆單核細(xì)胞增生李斯特菌流行株LM-SB2和LM-SB5進(jìn)行不同種類17種抗生素藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩株LM新疆流行株對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥；對(duì)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類、氯霉素類以及新生霉素抗菌藥物均敏感；對(duì)部分氨基糖苷類抗菌藥物敏感；對(duì)喹諾酮類耐藥性不明顯。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，同一種LM 流行株對(duì)不同種類抗菌藥物耐藥性存在差異，不同流行株對(duì)于同種抗菌藥物耐藥性也存在差異，如菌株LM-SB2對(duì)環(huán)丙沙星敏感，對(duì)阿米卡星表現(xiàn)中介；菌株LM-SB5 對(duì)環(huán)丙沙星中介，對(duì)阿米卡星敏感。因此，治療該病可根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍兄陮?duì)抗菌藥物的耐藥性，針對(duì)性地選擇適宜的抗菌藥物，并注意防止產(chǎn)生交叉耐藥性。加強(qiáng)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌耐藥性監(jiān)測(cè)力度，合理使用抗菌藥物，防止耐藥性進(jìn)一步擴(kuò)散，已逐漸成為關(guān)注的新課題[13-14]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌新疆流行株的研究發(fā)現(xiàn)，不同LM 新疆流行株之間的毒力存在差異。LM 對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性較強(qiáng)，因此，在畜牧生產(chǎn)當(dāng)中，合理使用抗生素，優(yōu)先考慮對(duì)LM敏感的抗菌藥物。