母豬乳汁樣本與血清樣本中圓環(huán)病毒抗體的相關(guān)性檢測(cè)分析

張濤濤，張 超

（石家莊市獸用生物制品供應(yīng)站，河北 石家莊 050000）

隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的集約化、規(guī)?；l(fā)展，以圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）為主的病毒病已成為規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)危害較大的傳染病。該病主要損害動(dòng)物機(jī)體的免疫器官，嚴(yán)重感染PCV-2豬群的藍(lán)耳病和偽狂犬病免疫抗體的陽(yáng)性率較低，表明感染PCV-2在一定程度上影響了機(jī)體的免疫功能[1]。自PCV-2 發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

有實(shí)驗(yàn)室曾針對(duì)中國(guó)部分地區(qū)PCV-2 流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，對(duì)福建省、江西省、河北省等共12個(gè)?。▍^(qū)、市）的健康豬群和發(fā)病豬群共452份樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示其中354 份樣品檢測(cè)為PCV-2 陽(yáng)性，感染率高達(dá)78.3%[2]。PCV-2的病死率為10%～20%，常與豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染[3]，是其他疾病的基礎(chǔ)疾病。有研究表明，母豬接種圓環(huán)病毒疫苗后，育肥豬圓環(huán)病的發(fā)病率大幅度降低，圓環(huán)病毒對(duì)免疫系統(tǒng)傷害的減少，同樣使副豬嗜血桿菌病和鏈球菌病的發(fā)病率降低[4]。有數(shù)據(jù)顯示，圓環(huán)病毒的免疫可間接提高豬瘟和口蹄疫的免疫抗體水平[5]。母豬接種疫苗后，PCV-2抗體不能通過(guò)胎盤傳遞，新生仔豬哺乳前基本無(wú)母源抗體，通過(guò)吮吸乳汁才可以獲得母源抗體[6]。Kedkovid 等[7]首次對(duì)泰國(guó)已感染PCV3的母豬群的初乳進(jìn)行PCV3的檢測(cè)鑒定，并就血清及初乳中抗體滴度的關(guān)系進(jìn)行了探討。

本試驗(yàn)采用ELISA 檢測(cè)方法對(duì)河北省某規(guī)?；i場(chǎng)送檢的76 份產(chǎn)房母豬血清及對(duì)應(yīng)的76 份乳汁樣本進(jìn)行PCV-2 抗體檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)血清、乳汁樣本中PCV-2 抗體水平，旨在統(tǒng)計(jì)分析乳汁、血清抗體水平之間的相關(guān)性，優(yōu)化免疫程序，提高豬場(chǎng)圓環(huán)病毒病防控能力。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

樣本來(lái)自河北省某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)，共計(jì)152份，分別為產(chǎn)后母豬血清樣本76 份及其對(duì)應(yīng)乳汁樣本76 份；其中1～46 號(hào)為初產(chǎn)母豬血清及其對(duì)應(yīng)乳汁樣本，47～76 號(hào)為2～3胎經(jīng)產(chǎn)母豬血清及其對(duì)應(yīng)乳汁樣本。

1.2 試劑與儀器

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）抗體酶免檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek 儀器有限公司）、微量移液器（艾本德股份公司）、全自動(dòng)洗板機(jī)、離心機(jī)、振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本及檢測(cè)試劑的制備

血清樣本：全血樣本1 000 r/min 離心10 min，取上清備用。乳汁樣本：全乳樣本1 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

檢測(cè)試劑：所使用試劑恢復(fù)至25 ℃，使用前輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混勻。

1.3.2 抗體檢測(cè)

采用ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)母豬血清樣本及其對(duì)應(yīng)乳汁樣本進(jìn)行PCV-2抗體檢測(cè)，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

檢測(cè)結(jié)果判定：置酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD450nm值。試驗(yàn)成立的條件是陰性對(duì)照孔平均OD450nm值小于等于0.150，陽(yáng)性對(duì)照平均OD450nm值大于等于0.600。樣品OD450nm值＜陽(yáng)性對(duì)照平均OD450nm×0.25時(shí)，判定為陰性；樣品OD450nm值≥陽(yáng)性對(duì)照平均OD450nm×0.25 時(shí)，判定為陽(yáng)性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行初步整理，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。母豬血清和對(duì)應(yīng)乳汁2 個(gè)樣本采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。當(dāng)母豬血清和對(duì)應(yīng)乳汁2個(gè)樣本數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)的顯著性P＞0.05，表示服從正態(tài)分布，可采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析；當(dāng)2 個(gè)樣本的Pearson 相關(guān)系數(shù)0.8＜R＜1.0，表示2 個(gè)樣本之間存在正相關(guān)且強(qiáng)相關(guān)，P＜0.01表示差異極顯著。

初產(chǎn)母豬血清和2～3胎次母豬血清樣本采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 母豬乳汁和血清PCV-2抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）

由表1可知，1～76號(hào)樣品的血清及乳汁樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)，根據(jù)公式計(jì)算，本試驗(yàn)的臨界值為0.421，即大于等于0.421判為陽(yáng)性，小于0.421判為陰性。其中10號(hào)、63號(hào)血清和乳汁樣本均為陰性，12 號(hào)、13 號(hào)、35 號(hào)母豬的乳汁樣本為陽(yáng)性，血清樣本為陰性，其余樣本檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

表1 母豬乳汁和血清PCV-2抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of PCV-2 antibody detection in serum samples and ow milk samples

2.2 試驗(yàn)?zāi)肛i血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本中PCV-2抗體水平之間的正態(tài)性檢驗(yàn)、相關(guān)系數(shù)、顯著性檢驗(yàn)分析

2.2.1 母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本PCV-2 抗體水平之間的正態(tài)性檢驗(yàn)（見(jiàn)表2）

由于母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本量均大于50，故以Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。由表2可知，母豬血清樣本及其對(duì)應(yīng)乳汁樣本2 組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布（P＞0.05），可繼續(xù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

表2 母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本PCV-2抗體水平之間的正態(tài)性檢驗(yàn)Tab.2 Normality test of PCV-2 antibody level between sow serum sample and corresponding milk sample

2.2.2 母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本PCV-2 抗體水平之間的相關(guān)性及顯著性檢驗(yàn)（見(jiàn)表3）

由表3 可知，母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本之間存在極顯著的線性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），母豬在免疫接種PCV-2疫苗后，可以通過(guò)檢測(cè)母豬乳汁抗體水平來(lái)推斷同期母豬血清抗體水平。母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本PCV-2 抗體水平存在正相關(guān)且強(qiáng)相關(guān)（R=0.815，0.8＜R＜1），結(jié)果表明，母豬乳汁抗體水平越高，同期母豬血清抗體水平越高。

表3 母豬血清樣本和對(duì)應(yīng)乳汁樣本PCV-2抗體水平之間的相關(guān)性及顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Relevance and sgnificance test of PCV-2 antibody level between sow serum smple and corresponding milk sample

2.3 不同胎次母豬群血清中PCV-2抗體結(jié)果（見(jiàn)表4）

由表4可知，初產(chǎn)母豬血清（1～46號(hào)）抗體OD450nm均值為1.082，明顯高于2～3 胎次母豬血清（47～76 號(hào)）抗體OD450nm均值0.726，表明胎次越高的母豬，體內(nèi)抗體水平越低。但2～3 胎次母豬血清的陽(yáng)性率為96.7%，高于初產(chǎn)母豬血清的陽(yáng)性率。

表4 不同胎次母豬群抗體結(jié)果Tab.4 PCV-2 antibody results of different parities of sow serum smple

2.3.1 初產(chǎn)母豬血清和2～3胎次母豬血清樣本的方差齊性檢驗(yàn)（見(jiàn)表5）

由表5 可知，初產(chǎn)母豬血清和2～3 胎次母豬血清樣本之間的方差為齊性（P＞0.05），可使用單因素方差分析方法。

表5 初產(chǎn)母豬血清和2～3胎次母豬血清樣本的方差齊性檢驗(yàn)Tab.5 Test for homogeneity of variance of primiparous sow serum and 2～3 parity sow serum sample

2.3.2 初產(chǎn)母豬血清和2～3胎次母豬血清樣本單因素方差分析（見(jiàn)表6）

由表6 可知，初產(chǎn)母豬血清和2～3 胎次母豬血清樣本之間是存在極顯著性差異（P＜0.01），結(jié)果表明，不同胎次母豬體內(nèi)血清PCV-2抗體水平差異顯著。

表6 初產(chǎn)母豬血清和2～3胎次母豬血清樣本單因素方差分析Tab.6 Single factor analysis of variance of primiparous sow serum and 2～3 parity sow serum sample

3 討論

通過(guò)檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析可知，該場(chǎng)母豬群PCV-2免疫抗體陽(yáng)性率較高，免疫效果整體良好。其中10號(hào)、63號(hào)血清及對(duì)應(yīng)乳汁抗體結(jié)果呈雙陰性，12 號(hào)、13 號(hào)、35 號(hào)血清抗體結(jié)果呈陰性，乳汁抗體結(jié)果呈陽(yáng)性，因OD450nm值處于臨界值邊緣，這些結(jié)果均可判定為免疫失敗。本試驗(yàn)結(jié)果與馬銘等[8]檢測(cè)新疆某規(guī)?；i場(chǎng)PCV-2 抗體以及張家瑞等[9]檢測(cè)新疆部分地區(qū)PCV-2 抗體的結(jié)論一致。引起免疫失敗的原因很多，包括漏免、免疫過(guò)程中劑量掌控不當(dāng)或者動(dòng)物自身情況等。鄭逢梅[10]曾針對(duì)豬場(chǎng)免疫失敗做過(guò)詳細(xì)論述。黎先偉等[11]指出，任何繼發(fā)感染或并發(fā)疾病引起機(jī)體免疫抑制因素均可降低PCV-2 疫苗的接種效果。針對(duì)上述兩種情況應(yīng)對(duì)母豬及其出生仔豬進(jìn)行及時(shí)補(bǔ)免。

通過(guò)對(duì)初產(chǎn)母豬血清（1～46 號(hào)）和2～3 胎次母豬血清（47～76號(hào)）中PCV-2抗體結(jié)果的單因素方差分析可知，不同胎次母豬體內(nèi)PCV-2抗體水平差異顯著，胎次越高的母豬，體內(nèi)抗體水平越低。初產(chǎn)母豬配種前一般做基礎(chǔ)免疫2次，間隔3 w，生產(chǎn)1個(gè)月前加強(qiáng)免疫一次；經(jīng)產(chǎn)母豬一般僅在生產(chǎn)1個(gè)月前跟胎免疫一次，主要防控母豬因PCV-2引起的繁殖障礙等問(wèn)題，因此經(jīng)產(chǎn)母豬抗體水平不如初產(chǎn)母豬，但抗體水平依然在保護(hù)范圍之內(nèi)，且經(jīng)產(chǎn)母豬由于產(chǎn)前的反復(fù)免疫，群體陽(yáng)性率高于初產(chǎn)母豬。吳波平[12]對(duì)福建省一起種豬場(chǎng)母豬生產(chǎn)異常情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)合調(diào)查情況推斷，木乃伊胎異常升高因母豬PCV-2免疫失敗和免疫空白導(dǎo)致，并通過(guò)對(duì)1～7胎次母豬的生產(chǎn)性能分析發(fā)現(xiàn)，隨著胎次增加，木乃伊胎個(gè)體發(fā)病率下降，此調(diào)查結(jié)果與本文結(jié)論一致。

根據(jù)Pearson 相關(guān)系數(shù)分析，可知血清和乳汁抗體檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)且強(qiáng)相關(guān)；根據(jù)顯著性判斷可知，血清抗體水平和乳汁抗體水平存在極顯著線性相關(guān)性，即血清抗體水平和乳汁抗體水平之間存在極顯著的強(qiáng)性正相關(guān)。結(jié)果表明，母豬在免疫接種PCV-2 疫苗后，可通過(guò)檢測(cè)乳汁中抗體水平評(píng)估母豬同期血清抗體水平，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整仔豬的免疫計(jì)劃。采集血清樣本過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致母豬應(yīng)激，應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈使垂體后葉分泌催產(chǎn)素受阻，導(dǎo)致母豬分娩后可能減乳或無(wú)乳[13]。研究乳汁檢測(cè)代替常規(guī)檢測(cè)已有很多成功案例，如，萬(wàn)積成等[14]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳汁中孕酮的水平所反映的發(fā)情周期階段與直腸檢查法所評(píng)估的結(jié)果相一致。楊玉英等[15]研究建立了一種牛乳中檢測(cè)結(jié)核抗體的方法，結(jié)果符合率達(dá)83.33%。相對(duì)于血清，乳汁的采集不僅減輕采樣人員的工作量，提高工作效率，也減少了對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激和損傷。因此，研究更快捷、方便的檢測(cè)技術(shù)對(duì)疫病防控具有重要意義。

4 結(jié)論

母豬免疫接種PCV-2疫苗后，可通過(guò)檢測(cè)乳汁中抗體水平評(píng)估母豬同期血清抗體水平，且不同胎次母豬群血清中PCV-2 抗體水平的具有差異性，胎次越高的母豬，體內(nèi)抗體水平越低。