嗜酸乳桿菌和氧化鋅對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、空腸形態(tài)和免疫功能的影響

李清豐，楊成迎，楊錦濤，支霄剛，周天英

（1.隆昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 隆昌 642150；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)院，重慶 402460；3.北京偉嘉飼料集團(tuán)，北京 100089；4.隆昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 隆昌 642150）

仔豬斷奶時(shí)可能導(dǎo)致腸道形態(tài)改變以及功能受損。大腸桿菌產(chǎn)腸毒素可導(dǎo)致仔豬斷奶生長(zhǎng)產(chǎn)性能降低，病死率升高[1]?？股氐臑E用導(dǎo)致藥物在畜產(chǎn)品中法人殘留，并產(chǎn)生多重耐藥性。因此，尋找安全的抗生素替代品成為亟待解決的難題。研究表明，日糧中添加乳桿菌和ZnO可顯著改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能及健康狀況[2-3]。鋅屬于重金屬，易在土壤中累積，因此，短期內(nèi)鋅在斷奶仔豬日糧中的添加量應(yīng)≤3 000 mg/kg[4]。目前，日糧中同時(shí)添加ZnO和益生菌對(duì)斷奶仔豬的影響機(jī)制尚不明確。本研究旨在探究嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA）和ZnO 對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能以及對(duì)口服大腸桿菌K88 仔豬空腸形態(tài)和免疫功能的影響，為L(zhǎng)A 和ZnO 在斷奶仔豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ZnO、LA 均購(gòu)自南京邦諾生物科技有限公司，嗜酸乳桿菌活菌量約為5×1010CFU/g。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）、熒光定量PCR 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）、熒光定量PCR 儀器（7900HT，ABI公司）、ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于重慶市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。選取平均體重為（7.24±0.21）kg 的28 日齡三元雜交斷奶仔豬120 頭，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭豬。采用2×2試驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括2 水平的LA（0、4×1010CFU/kg）及2 水平的ZnO（0、0.1%）。日糧中未添加LA 和ZnO 為對(duì)照組，僅添加LA、ZnO 的組分別為L(zhǎng)A 組和ZnO 組，同時(shí)添加LA 和ZnO組為L(zhǎng)A×ZnO組。試驗(yàn)期30 d，期間仔豬自由采食和飲水，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Basal diet composition and nutritional level(air-dry basis)

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第30 d，8：00對(duì)仔豬進(jìn)行稱重。每個(gè)重復(fù)挑選一頭與平均體重接近的仔豬，灌服1×1010CFU/mL大腸桿菌K88 稀釋液10 mL；對(duì)照組每個(gè)重復(fù)中挑選1 頭仔豬為空白對(duì)照組，灌服等體積的生理鹽水。6 h后注射戊巴比妥，解剖仔豬，沿腸系膜附件縱向切開3 cm 的上行空腸段，0.9%NaCl溶液沖洗，10%中性福爾馬林固定，采集約10 g空腸樣本，液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)第0 d 和第30 d 時(shí)稱量所有仔豬的體重，記錄飼料消耗情況，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）以及料重比（F/G）。

1.4.2 空腸形態(tài)

截取約5 μm固定的空腸樣本，石蠟包埋，使用蘇木精和伊紅亞甲藍(lán)染色進(jìn)行組織學(xué)分析。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)絨毛及相應(yīng)隱窩，顯微鏡觀察黏膜結(jié)構(gòu)，利用Motic軟件測(cè)量絨毛高度（VH）、絨毛寬度（VW）以及隱窩深度（CD），計(jì)算絨毛高度和隱窩深度比（VH/CD）。

1.4.3 免疫功能

采用TRIzol法提取冷凍空腸樣本總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)黏蛋白2（MUC2）和β 防御素3（DEFB3）的mRNA 表達(dá)量。以βactin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt 法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢測(cè)豬空腸中免疫球蛋白A（IgA）的含量。試驗(yàn)操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試驗(yàn)所用引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primersequences

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey's法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LA和ZnO對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見表3）

由表3 可知，與對(duì)照組相比，LA 組、LA×ZnO 組的仔豬ADG 均顯著升高（P＜0.05）；ZnO 組的仔豬ADG 有升高趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；LA 組、ZnO 組以及LA×ZnO組仔豬料重比均顯著降低（P＜0.05）。

表3 LA和ZnO對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響（n=30）Tab.3 Effect of LA and ZnO on the growth performance of piglets(n=30)

LA和ZnO對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響無(wú)顯著的交互作用（P＞0.05）。

2.2 LA和ZnO對(duì)仔豬空腸形態(tài)的影響（見表4）

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，對(duì)照組空腸VH、VW及VH/CD 均 顯 著 降 低（P＜0.05），空 腸CD 顯 著 升 高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，LA、LA×ZnO 組仔豬的空腸VH、VW 以及VH/CD 均顯著升高（P＜0.05），CD 顯著降低（P＜0.05）；ZnO組仔豬空腸VH/CD顯著升高（P＜0.05）。但LA 與ZnO 對(duì)斷奶仔豬的空腸形態(tài)無(wú)顯著的交互作用（P＞0.05）。

表4 LA和ZnO對(duì)仔豬空腸形態(tài)的影響（n=6）Tab.4 Effect of LA and ZnO on the morphometric characteristics of the jejunal mucosa of piglets(n=6)

2.3 LA和ZnO對(duì)仔豬免疫功能的影響（見表5）

由表5 可知，對(duì)照組仔豬空腸中MUC2、DEFB3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量及IgA 含量均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，LA 處理組、ZnO 處理組、LA×ZnO處理組均仔豬空腸中MUC2和DEFB3 mRNA表達(dá)量均極顯著提高（P＜0.01），LA處理組空腸組織中IgA的含量顯著增加（P＜0.05）。LA和ZnO對(duì)空腸中基因表達(dá)和IgA含量的影響無(wú)顯著交互作用（P＞0.05）。

表5 LA和ZnO對(duì)仔豬免疫功能的影響（n=6）Tab.5 Effect of LA and ZnO supplementation on the immune function of piglets(n=6)

3 討論

3.1 LA和ZnO對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

斷奶應(yīng)激損害仔豬腸道黏膜屏障，增加腸道通透性，導(dǎo)致胃腸易發(fā)生疾病，影響生長(zhǎng)性能。LA 通過(guò)定植于宿主腸上皮細(xì)胞，并代謝產(chǎn)生有機(jī)酸等物質(zhì)，抑制有害菌生長(zhǎng)，維持宿主腸道菌群平衡，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。ZnO可維持腸道細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，減緩斷奶仔豬腸道通透性增加，緩解腸道功能紊亂[6]，促進(jìn)機(jī)體吸收利用養(yǎng)分。

本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加4×1010CFU/kg 的LA 或0.1%的ZnO均可顯著提高仔豬ADG，顯著降低F/G。Qiao等[2]研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸桿菌或ZnO可顯著提高仔豬ADFI和ADG，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，可推測(cè)LA 和ZnO 均具有促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)的功能，并具有減弱斷奶應(yīng)激的影響。

3.2 LA和ZnO對(duì)仔豬空腸形態(tài)的影響

大腸桿菌促進(jìn)腸道分泌腸毒素，引起機(jī)體內(nèi)電解質(zhì)紊亂，導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉，破壞腸道內(nèi)部免疫防護(hù)屏障[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA 組的仔豬空腸VH、VW 和VH/CD 顯著高于對(duì)照組仔豬，CD 則顯著降低；ZnO 組的斷奶仔豬空腸VH/CD較對(duì)照組顯著提高；LA 和ZnO 單獨(dú)或同時(shí)添加均可改善大腸桿菌感染的仔豬空腸黏膜的形態(tài)學(xué)特征。

仔豬斷奶期間，仔豬抵御外來(lái)病原菌最有效的物質(zhì)是益生菌。乳酸桿菌通過(guò)改善腸道內(nèi)部的pH 值、促進(jìn)胞外多糖分泌等途徑抑制病原菌生長(zhǎng)，維持腸道內(nèi)部微生物群平衡、保持腸道上皮完整，改善機(jī)體健康狀況[8]。ZnO能夠維持腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)腸道內(nèi)部有益菌群繁殖，維持機(jī)體免疫防護(hù)功能[6]。祁鳳華等[8]研究表明，日糧中添加0.1%的LA 可顯著增加肉雞小腸VH、VH/CD。呂航[9]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加氧化鋅能夠顯著提高斷奶仔豬空腸VH和VH/CD。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果類似，表明日糧中添加LA 和ZnO 可顯著改善仔豬空腸形態(tài)，但兩者間無(wú)顯著的交互作用。

3.3 LA和ZnO對(duì)仔豬免疫功能的影響

消化道及相關(guān)免疫防御機(jī)制的發(fā)育，對(duì)優(yōu)化飼養(yǎng)方式非常重要。黏液層由高度糖基化的黏液蛋白組成，MUC2是此類黏蛋白的一種，因此，MUC2 的合成可能是影響腸道屏障的潛在因素[10]。DEFB通過(guò)破壞病原菌的生物膜或病毒外殼蛋白消滅病原微生物，激活機(jī)體獲得性免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫水平[11]。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鋅添加量的升高，空腸中MUC2的mRNA表達(dá)量隨之增加。李云燕等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)LA 處理的小鼠腸道MUC2 表達(dá)量不斷提高，表明LA 具有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的功能。Yoshida等[14]研究表明，仔豬口服植物乳桿菌Lq80 可提高斷奶仔豬腸道中IgA 含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組仔豬空腸中MUC2、DEFB3 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量及IgA 含量顯著低于空白對(duì)照組，表明經(jīng)過(guò)大腸桿菌處理后仔豬腸道內(nèi)部免疫屏障及功能可能被損害；各處理組仔豬在灌服大腸桿菌后空腸中MUC2、DEFB3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，LA組空腸中IgA含量顯著低于對(duì)照組。日糧中添加LA、ZnO影響了仔豬的免疫反應(yīng)，并且能夠減弱大腸桿菌K88的影響，提高仔豬的生長(zhǎng)性能。

4 結(jié)論

日糧中添加LA 和ZnO 均可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，且對(duì)大腸桿菌K88攻毒后的仔豬空腸發(fā)育和免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，但LA和ZnO之間無(wú)顯著的交互作用。