HIF-2α 在不同年齡段牦牛肺臟中的表達(dá)及分布

陳樹(shù)吾，楊 琨，姚一凡，張 蘭，鐘 文，喬自林，劉翊中*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

青藏高原具有獨(dú)特的高寒、低氧環(huán)境。長(zhǎng)期暴露在高原缺氧環(huán)境中的哺乳動(dòng)物，易患肺高血壓、右心室肥大等高地疾病[1-2]。在低氧壓力下，機(jī)體低氧誘導(dǎo)因子表現(xiàn)的穩(wěn)定性提高。低氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）是肺血管對(duì)急性和慢性低氧做出反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)控血管再生的功能，包括細(xì)胞增殖、血細(xì)胞成熟、血管生成、肺血管發(fā)育和胚胎發(fā)育等[3-4]。HIF-2α 的表達(dá)調(diào)節(jié)以蛋白質(zhì)水平為主，HIF-2α是調(diào)節(jié)低氧生理機(jī)制的重要中樞，在低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病和進(jìn)程中參與調(diào)節(jié)[5]。牦牛已在形態(tài)和生理上適應(yīng)了青藏高原高寒、低氧環(huán)境。因此，本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了2 個(gè)年齡段牦牛肺臟HIF-2α 的表達(dá)，研究其分布特征，為了解高原低氧環(huán)境下的適應(yīng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品于2019 年10 月份在甘肅省合作市屠宰場(chǎng)獲取，為各3頭份的3歲與6歲健康牦牛的肺臟組織，采用4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 樣品處理

取1 cm3肺臟組織制成石蠟切片，切厚度為4～5 μm樣品貼附于載玻片，HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 試驗(yàn)試劑

多克隆抗體HIF-2α（bs-1447R）和抗兔SP 試劑盒（SP-0023），均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB染色試劑盒（C02-04001），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組化檢測(cè)

石蠟切片置于40 ℃烤爐30 min 烤化石蠟，經(jīng)脫蠟復(fù)水，PBS 洗滌5 min，抗原修復(fù)后利用SP 試劑盒阻斷封閉，滴加1∶100 比例稀釋的HIF-2α 兔多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜（陰性對(duì)照組抗體為山羊血清）。次日，擦除一抗PBS浸泡滴加二抗，DAB 顯色液顯色適宜即終止反應(yīng)，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。

1.4.2 圖像采集及結(jié)果判定

利用光學(xué)顯微鏡觀察拍攝染色組織切片圖像，采用Image-Pro-Plus（6.0 版）定量檢測(cè)HIF-2α 的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果。測(cè)量參數(shù)包括面積和積分光密度（IOD），并根據(jù)所測(cè)的IOD和所測(cè)區(qū)域面積得到平均光密度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)HIF-2α 平均IOD 值進(jìn)行單因素方差分析，并對(duì)HIF-2α 進(jìn)行方差分析平均，IOD 采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1）

由圖1 可知，2 個(gè)年齡段牦牛肺臟的結(jié)構(gòu)組織發(fā)育狀況良好，未發(fā)現(xiàn)病變部位。切片中可觀察到牦牛肺臟實(shí)質(zhì)部分的組織分布明顯，較易區(qū)分。

圖1 牦牛肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Histological structure of yak lung

2.2 牦牛肺臟HIF-2α蛋白免疫組織化學(xué)染色（見(jiàn)圖2）

由圖2可知，3歲牦牛肺臟免疫組織化學(xué)染色中，末端支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中HIF-2α 蛋白呈陽(yáng)性；HIF-2α 蛋白在6 歲牦牛肺臟的末端支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性，在肺血管和肌細(xì)胞中呈陽(yáng)性。6 歲牦牛肺臟HIF-2α 在終末細(xì)支氣管的免疫染色強(qiáng)度強(qiáng)于3歲牦牛。

圖2 牦牛肺臟HIF-2α蛋白免疫組織化學(xué)染色Fig.2 Immunohistochemical staining of HIF-2α protein in yak lung

2.3 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度（見(jiàn)圖3、表1）

圖3 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度Fig.3 Average optical density of HIF-2α in yak lungs

表1 牦牛肺臟HIF-2α的平均光密度Tab.1 Average optical density of HIF-2α in yak lungs

由圖3、表1可知，6歲牦牛肺臟HIF-2α在終末細(xì)支氣管的免疫染色強(qiáng)度相與3 歲牦牛差異極顯著（P＜0.01），HIF-2α 在肺泡中3 歲和6 歲免疫組化染色結(jié)果與終末細(xì)支氣管中結(jié)果相似。

3 討論

牦牛肺臟結(jié)構(gòu)與黃牛不同。牦牛肺的肺血液空氣屏障比黃牛更薄，有利于牦牛在高海拔低氧地區(qū)氣體交換過(guò)程中促進(jìn)氧氣擴(kuò)散[6]。低氧可迅速增加細(xì)胞內(nèi)的HIF-2α蛋白含量，HIF-2α 可通過(guò)脯氨酸羥化酶和天冬酰胺羥化酶羥化途徑被降解，因此其活性受含氧水平調(diào)節(jié)[7]。HIF-2α可激活下游部分靶基因如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，低氧環(huán)境下EPO 與VEGF之間調(diào)節(jié)機(jī)體的生理病理反應(yīng)有一定的功能相似性[5]。慢性低氧期還能夠增強(qiáng)HIF-2α 的穩(wěn)定性[8]。在高原低氧環(huán)境下，HIF-2α進(jìn)化速率最快，并且能夠調(diào)節(jié)下游靶基因和鐵代謝，降低了哺乳動(dòng)物慢性高原病的發(fā)病率[9-10]。低氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的HIF-2α表達(dá)量明顯高于常氧狀態(tài)[11]。

本研究結(jié)果顯示，6歲牦牛肺臟中HIF-2α的表達(dá)顯著高于3 歲牦牛。Ebersole 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴的黏膜組織中HIF-1α和HIF-2α與衰老呈正相關(guān)，其結(jié)果與本研究結(jié)果相似。HIF-2α還可通過(guò)破壞代謝穩(wěn)態(tài)和線粒體凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞抵抗凋亡[13-14]，也可能是因年齡增長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡增加而導(dǎo)致HIF-2α 表達(dá)量增加。正常環(huán)境中，HIF-2α 更多在一些組織器官胚胎發(fā)育時(shí)表達(dá)，在成人細(xì)胞中的表達(dá)量較少。姜華鵬等[15]研究表明，HIF-2α在細(xì)胞長(zhǎng)期低氧適應(yīng)性中起到重要作用，與本研究中隨著年齡增長(zhǎng)，牦牛在低氧條件下生活時(shí)間與HIF-2α表達(dá)量呈正相關(guān)的結(jié)果相一致。牦牛隨著年齡的增長(zhǎng)，肺臟中HIF-2α逐漸增加，遷移能力顯著上升，其抗損傷能力也隨之上升，以此滿足細(xì)胞增生，應(yīng)對(duì)牦牛所生活的高原環(huán)境。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)在3 歲牦牛與6 歲牦牛肺臟中觀察HIF-2α表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白于3歲牦牛肺臟組織中在終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中為陽(yáng)性表達(dá)；在6歲牦牛肺臟組織中在終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在肺血管和肌細(xì)胞中為陽(yáng)性表達(dá)。低氧能夠促進(jìn)HIF-2α 在牦牛肺臟中的表達(dá)，并隨年齡增長(zhǎng)而上升，進(jìn)而推測(cè)HIF-2α 因子對(duì)牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境具有重要作用。