重度冷應(yīng)激對(duì)三河牛血液生化指標(biāo)及相關(guān)基因表達(dá)的影響

李 瑋，劉 蕤，馬 堯，李金龍，吳宏軍，劉愛榮，俞 英，徐 青，王雅春*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種試驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京100193； 2.北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021； 4.內(nèi)蒙古謝爾塔拉種牛場(chǎng)，海拉爾 021008；5.內(nèi)蒙古海拉爾農(nóng)墾集團(tuán)，海拉爾 021008)

重度冷應(yīng)激對(duì)三河牛血液生化指標(biāo)及相關(guān)基因表達(dá)的影響

李 瑋1，3，劉 蕤1，馬 堯2，李金龍2，吳宏軍4，劉愛榮5，俞 英1，徐 青2，王雅春1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種試驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京100193； 2.北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021； 4.內(nèi)蒙古謝爾塔拉種牛場(chǎng)，海拉爾 021008；5.內(nèi)蒙古海拉爾農(nóng)墾集團(tuán)，海拉爾 021008)

本研究旨在檢測(cè)與牛冷應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的生化指標(biāo)，篩選參與牛冷應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)基因。以內(nèi)蒙古三河牛為研究對(duì)象，對(duì)30頭青年牛進(jìn)行室外-32 ℃冷應(yīng)激處理3 h，采集冷應(yīng)激前后試驗(yàn)個(gè)體血樣，檢測(cè)血液生化指標(biāo)及基因表達(dá)量的變化。冷應(yīng)激3 h后，試驗(yàn)個(gè)體T3、T4及ACTH3個(gè)血液生化指標(biāo)極顯著升高(P<0.01)。mRNA差異顯示方法(DDRT)檢測(cè)到基因LIN54和KLF12在冷應(yīng)激后表達(dá)量降低，熒光定量RT-PCR驗(yàn)證了冷應(yīng)激后2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(LIN54下調(diào)顯著(P<0.05)，KLF12下調(diào)極顯著(P<0.01))的結(jié)果。篩選到的2個(gè)基因分別屬于LINC和KLF家族，LINC參與有絲分裂基因的活化，KLF參與細(xì)胞增殖和凋亡。T3、T4及ACTH 3項(xiàng)生化指標(biāo)可以初步作為衡量三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱的侯選指標(biāo)在大群體中進(jìn)行驗(yàn)證，篩選到的2個(gè)基因，可作為參與三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)的重要侯選基因，進(jìn)一步研究2個(gè)基因在牛冷應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制，綜合這些生化指標(biāo)及侯選基因表達(dá)的變化，用于評(píng)價(jià)個(gè)體冷應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度，在三河?？估鋺?yīng)激育種中將具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

冷應(yīng)激；三河牛；生化指標(biāo)；基因表達(dá)；mRNA差異顯示

應(yīng)激(Stress)是指機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部的各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。溫度應(yīng)激是應(yīng)激反應(yīng)中最常見的一種，包括熱應(yīng)激和冷應(yīng)激。冷應(yīng)激是我國(guó)北方高寒地區(qū)一種最普遍的應(yīng)激因素，在這些高寒地區(qū)，冬春寒冷季節(jié)達(dá)5個(gè)月之久，寒流常伴有暴風(fēng)雪天氣。由于低溫而導(dǎo)致的冷應(yīng)激常引起畜禽機(jī)體生理平衡的破壞，導(dǎo)致免疫力下降，表現(xiàn)為生長(zhǎng)放緩、生產(chǎn)性能下降、繁殖力降低、發(fā)病率和死亡率高等。北方地區(qū)是我國(guó)畜禽養(yǎng)殖的主要地區(qū)，因此冷應(yīng)激給我國(guó)北方地區(qū)的畜牧業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，是制約我國(guó)畜牧業(yè)高效發(fā)展的主要因素之一。

在冷應(yīng)激狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體啟動(dòng)一系列非特異性的自身免疫反應(yīng)來中和應(yīng)激的影響，這個(gè)過程會(huì)導(dǎo)致血液中一些生化分子的濃度發(fā)生變化。近年來，對(duì)小鼠的冷應(yīng)激相關(guān)研究已證明，冷應(yīng)激可導(dǎo)致動(dòng)物促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH) 的分泌增加，從而作用于腎上腺，調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇的合成和分泌，以使機(jī)體增強(qiáng)適應(yīng)性，保持體內(nèi)平衡[1]。另一方面，冷應(yīng)激可導(dǎo)致動(dòng)物較短時(shí)間內(nèi)血液中促甲狀腺激素(TSH)的分泌增加，從而引起血清中三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)水平升高，而不同動(dòng)物冷應(yīng)激后不同時(shí)間內(nèi)T3和T4的變化不同[2]。血漿皮質(zhì)酮(CORT)的濃度在動(dòng)物急性冷應(yīng)激時(shí)分泌增加，使動(dòng)物可以抵御外界低溫環(huán)境的刺激。K.Fukuhara等[3]報(bào)道，大鼠在冷應(yīng)激1 h后血漿皮質(zhì)酮水平增加，9 h后趨向于正常，24 h時(shí)仍高于對(duì)照水平，而冷應(yīng)激5 d時(shí)只稍高于對(duì)照水平。開產(chǎn)前金定蛋鴨冷應(yīng)激12 h內(nèi)，CORT的含量前期上升迅速，后期變化規(guī)律不明顯[4]。此外，動(dòng)物冷應(yīng)激反應(yīng)中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)與紅細(xì)胞鉀含量的變化也有較多報(bào)道[5-7]。

冷應(yīng)激反應(yīng)是生物機(jī)體的一種整體變化，涉及到機(jī)體多系統(tǒng)、多層次的協(xié)調(diào)效應(yīng)[8-9]。關(guān)于動(dòng)物冷應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制及受冷應(yīng)激調(diào)控的基因有很多報(bào)道，大約有幾十種基因參與機(jī)體的冷應(yīng)激反應(yīng)。其中研究較多的有熱休克蛋白基因(HSPs)、解偶聯(lián)蛋白基因(UCPs)、冷誘導(dǎo)結(jié)合RNA蛋白基因(CIRP)、金屬硫蛋白基因(MT)。李忠秋等[10]在對(duì)豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行的冷應(yīng)激研究中發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)HSP90的表達(dá)量顯著上調(diào)，且隨著溫度的降低而升高。李士澤等[11]、吳永魁等[12]分別對(duì)大鼠和仔豬進(jìn)行冷應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)HSP70蛋白表達(dá)量在組織及淋巴細(xì)胞中均上調(diào)。金福厚等[13]從冷處理的BALB/C鼠的睪丸組織中克隆出CIRP的cDNA，表明CIRP在生物體中能夠被低溫誘導(dǎo)，可能防止生物體遭受冷損傷。谷愛梅等[14]通過對(duì)NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染MTⅡA基因，檢測(cè)到MT表達(dá)的上調(diào)可提高細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性，且隨其含量的升高耐受性增大。這些基因的表達(dá)變化和冷應(yīng)激強(qiáng)度及冷應(yīng)激過程密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)動(dòng)物冷應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱的另一種有效的標(biāo)志物。目前，篩選差異表達(dá)基因的技術(shù)主要有扣除雜交、抑制消減雜交、mRNA差異顯示等多種[15-16]。 其中，mRNA差異顯示技術(shù)[17](Differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)具有速度快、操作簡(jiǎn)便，能夠檢測(cè)低豐度mRNA、靈敏度高，花費(fèi)較低等優(yōu)點(diǎn)[18-20]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)畜禽冷應(yīng)激的研究較少，而對(duì)牛冷應(yīng)激相關(guān)的生化指標(biāo)和基因的篩選研究的相關(guān)報(bào)道更少。本研究以內(nèi)蒙古三河牛為試驗(yàn)群體，-32 ℃冷應(yīng)激3 h，檢測(cè)試驗(yàn)個(gè)體應(yīng)激前后血液生化指標(biāo)及基因的表達(dá)變化，篩選三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的血液生化指標(biāo)及差異表達(dá)基因，初步探討三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

隨機(jī)選取內(nèi)蒙古謝爾塔拉牛場(chǎng)三河牛群體中體質(zhì)健康、體重相近、月齡相近且無親緣關(guān)系的30頭青年母牛，飼養(yǎng)于同一牛舍內(nèi)。采用配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行冷應(yīng)激前后三河牛血液生化指標(biāo)和基因差異表達(dá)的試驗(yàn)。該牛場(chǎng)為磚瓦結(jié)構(gòu)，牛群采用半舍飼飼養(yǎng)方式，飼喂全混合日糧。試驗(yàn)動(dòng)物在溫度為5 ℃左右的牛舍內(nèi)過夜飼養(yǎng)15 h，然后在室外平均氣溫-32 ℃的低溫環(huán)境中冷處理3 h。分別采集冷應(yīng)激前后牛頸靜脈抗凝血10 mL，非抗凝血10 mL。

1.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

取所有30頭青年母牛的新鮮非抗凝血各10 mL，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清檢測(cè)GSH-Px、T3、T4、ACTH、CORT的含量，收集紅細(xì)胞檢測(cè)鉀離子含量。所有生化指標(biāo)均委托北京華英生物技術(shù)研究所采用放射免疫分析法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 血液白細(xì)胞總RNA提取

取30頭青年母牛的新鮮抗凝血各10 mL， 3 000 r·min-1離心10 min，吸取白膜層細(xì)胞，加入1.5 mL RNA固定液中，-80 ℃低溫冷凍保存，用于RNA的提取。采用TRIzol Reagent(Invitrogen)提取總RNA，取200 μL加入RNA固定液的白細(xì)胞樣品，加入1 mL TRIzol，充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000檢測(cè)總RNA的含量和純度，2%瓊脂糖檢測(cè)總RNA完整性。

1.4 反轉(zhuǎn)錄和DDRT-PCR

在30頭青年母牛中任選6個(gè)個(gè)體樣本用于DDRT-PCR試驗(yàn)，200 ng總RNA，加入2 μL 50 μmol·L-1錨定引物，用RNase-free水調(diào)至14 μL，70 ℃保溫10 min后，迅速置于冰上冷卻。加入4 μL 5×M-MLV Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTP mixture，0.5 μL 40 U·μL-1RNase inhibitor，0.5 μL 200 U·μL-1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)，42 ℃保溫1 h，70 ℃處理15 min，終止反應(yīng)。以cDNA產(chǎn)物為模板，3條錨定引物和24條隨機(jī)引物(表3)兩兩組合進(jìn)行DDRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，其中2 μL 10×PCR Buffer，1.5 μL dNTP mixture(2.5 mmol·L-1)，0.2 μLTaq聚合酶(5 U·μL-1)，錨定引物(10 μmol·L-1)1 μL，隨機(jī)引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，滅菌去離子水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，38 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，40 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，15個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。3條錨定引物和24條隨機(jī)引物的序列詳見表3。

1.5 差異片段的PAGE凝膠電泳，銀染顯示及克隆測(cè)序

取DDRT-PCR產(chǎn)物4 μL，加入2 μL上樣緩沖液，6%非變性聚丙烯酰胺凝膠130 V電泳12～14 h，至溴酚藍(lán)離膠底1.5 cm時(shí)結(jié)束電泳，進(jìn)行銀染。去離子水中漂洗5 min，10%乙醇固定10 min，1% AgNO3染色10 min，2.5% NaOH洗5 min，甲醛顯色至條帶清晰。記錄分子量為100～1 000 bp，清晰可辨，可以重復(fù)擴(kuò)增的差異顯示片段。按同一擴(kuò)增片段在試驗(yàn)個(gè)體冷應(yīng)激前后出現(xiàn)與否進(jìn)行差異表達(dá)片段的篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)：在3個(gè)以上個(gè)體中變化同時(shí)出現(xiàn)，即作為差異表達(dá)的候選片段?；厥詹町惐磉_(dá)的候選片段，采用與原PCR相同的引物組合和反應(yīng)條件，進(jìn)行二次擴(kuò)增，克隆質(zhì)粒酶切鑒定正確后，委托華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，用BLAST軟件進(jìn)行序列分析。

1.6 熒光定量RT-PCR

對(duì)通過DDRT-PCR篩選到的候選差異基因，采用熒光定量RT-PCR進(jìn)一步在30個(gè)個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證。使用PrimerScript RT regent Kit(TaKaRa)合成cDNA第一鏈，凍存于-40 ℃。以Ensemble上牛的基因組序列為模板，采用Primer 3設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)。用SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，每個(gè)個(gè)體設(shè)置3次重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過Ct法計(jì)算該個(gè)體目的基因冷應(yīng)激前后目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

冷應(yīng)激前后血液中6項(xiàng)生化指標(biāo)的數(shù)據(jù)，運(yùn)用SAS9.1軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，再利用GLM過程分析各因素對(duì)生化指標(biāo)變化的影響，模型中考慮體重和月齡；熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。所有數(shù)值用“Mean±SD”表示。

2 結(jié) 果

2.1 冷應(yīng)激前后三河牛血清生化指標(biāo)的變化分析

對(duì)30頭三河牛冷應(yīng)激前后的6項(xiàng)血液生化指標(biāo)：血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮(CORT)、紅細(xì)胞鉀含量進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2。三河牛冷應(yīng)激3 h后，檢測(cè)的6項(xiàng)血液生化指標(biāo)中，T3、T4和ACTH含量極顯著升高(P<0.01)，其余幾項(xiàng)指標(biāo)未表現(xiàn)出顯著差異，而試驗(yàn)個(gè)體體重和月齡對(duì)各生化指標(biāo)的變化無顯著影響(P>0.05)。

表1 熒光定量RT-PCR引物

Table 1 Primers for Real-time PCR

基因名稱Genename引物序列(5′?3′)PrimersequenceKLF12Forward：GCAAAGCACAAATGGACCCC，Reverse：AGGGCCGTAGATCCAGTTTCLIN54Forward：CTCTGGTCCGGTAATCACGA，Reverse：GAACCCTACCTGCAATGACCGAPDHForward：GGCGCCAAGAGGGTCAT，Reverse：AGGCATTGCTGACAATCTTGAG

表2 三河牛冷應(yīng)激前后血液中相關(guān)生化指標(biāo)的變化

Table 2 Changes of the blood biochemical parameters of Sanhe cattle before and after cold stress

T3/(ng·mL-1)T4/(ng·mL-1)ACTH/(pg·mL-1)CORT/(ng·mL-1)GSH?PX/(U·mL-1)K+/(mmol·L-1)應(yīng)激前Beforecoldstress0．84±0．17a38．93±7．29a19．88±4．70a248．69±14．69801．11±50．9419．39±4．28應(yīng)激后Aftercoldstress1．34±0．32b50．03±8．03b27．74±6．63b248．76±21．5784．21±107．4919．68±4．75

同列中不同肩注字母表示差異極顯著(P<0.01)

Different letters in the same row mean extremely significant difference between the treatments (P<0.01)

2.2 DDRT-PCR結(jié)果

本研究利用文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的3條錨定引物和24條隨機(jī)引物配對(duì)組合，采用高低嚴(yán)謹(jǐn)(先經(jīng)過25個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)PCR循環(huán)，再采用15個(gè)高嚴(yán)謹(jǐn)PCR循環(huán))相結(jié)合的PCR方法，將大小為100～1 000 bp，清晰可見，相同的差異在3個(gè)以上個(gè)體中重現(xiàn)的片段記錄為差異片段，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)21條冷應(yīng)激前后表達(dá)量有差異的片段，表3提供了獲得21個(gè)差異片段的引物組合、大小等詳細(xì)信息，部分差異顯示結(jié)果見圖1 A。

將21條差異表達(dá)片段經(jīng)過二次PCR擴(kuò)增、回收、克隆后，最后得到11個(gè)大小正確的陽性克隆質(zhì)粒，對(duì)11個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)2條序列分別與牛的2個(gè)基因同源，引物組合H-T11A/AP5所得差異片段位于牛基因組6號(hào)染色體LIN54基因的第一個(gè)外顯子(ENSBTAE00000113827)區(qū)，而H-T11A/AP12所得差異片段位于?；蚪M12號(hào)染色體KLF12基因的第一個(gè)外顯子(ENSBTAE00000440535)區(qū)。Blast比對(duì)結(jié)果表明，這2個(gè)基因在人、小鼠、牛及其他一些物種之間具有較高的保守性(表4)。

2.3 差異基因的熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

采用SYBR Green熒光標(biāo)記的方法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)2個(gè)差異表達(dá)基因LIN54和KLF12進(jìn)行驗(yàn)證。在mRNA差異顯示的銀染膠圖譜中(圖1A)，與冷應(yīng)激前相比，2個(gè)基因冷應(yīng)激后表達(dá)下調(diào)。從基因的定量PCR結(jié)果可以看出(圖1B)，2個(gè)差異顯示基因的相對(duì)表達(dá)量冷應(yīng)激后顯著下調(diào)，這與mRNA差異顯示的銀染圖譜結(jié)果一致，其中KLF12極顯著下調(diào)(P<0.01)，LIN54顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

當(dāng)機(jī)體遇到冷環(huán)境的刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)T3和T4的含量迅速升高，T3的升高可增強(qiáng)Na+/K+-ATPase的活性，促進(jìn)Na+、K+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，引起紅細(xì)胞內(nèi)K+含量的改變，并導(dǎo)致體內(nèi)ATP消耗的增加，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱增加。冷應(yīng)激會(huì)激活下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HTP)，導(dǎo)致促甲狀腺激素釋放激素的分泌增加，從而引起血液中甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)含量的升高。在本研究中，三河牛冷應(yīng)激前后血清中T3、T4和ACTH的變化顯著，這與已有的研究報(bào)道一致，提示這3項(xiàng)生化指標(biāo)可以作為衡量三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱的輔助指標(biāo)。本研究沒有發(fā)現(xiàn)其他指標(biāo)的顯著變化，可能是由于冷處理時(shí)間較短，或者三河牛對(duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性[22-24]等原因造成的。因?yàn)椴煌N屬動(dòng)物對(duì)冷應(yīng)激的反應(yīng)不盡相同，甚至同一種屬對(duì)不同時(shí)間和不同強(qiáng)度的冷應(yīng)激所做出的反應(yīng)也不同。對(duì)小鼠和豬進(jìn)行不同程度的急性冷應(yīng)激后，血液中ACTH、T3、T4的含量顯著升高，但延長(zhǎng)冷應(yīng)激時(shí)間或停止冷應(yīng)激后，T3和T4的含量都會(huì)有下降的趨勢(shì)[25-26]。因此，利用血液中生化指標(biāo)的變化來衡量三河牛冷應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)弱，還需要更為詳盡的研究，而利用分子生物學(xué)手段，篩選與三河牛冷應(yīng)激相關(guān)的分子標(biāo)記，再綜合生化指標(biāo)變化的數(shù)據(jù)，可能會(huì)更準(zhǔn)確地反應(yīng)個(gè)體對(duì)冷應(yīng)激的反應(yīng)，在三河?？估鋺?yīng)激育種中具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

表3 DDRT-PCR引物及冷應(yīng)激前后差異表達(dá)片段

Table 3 Primers for DDRT-PCR and fragments expressed differentially before and after cold stress

引物PrimerH?T11A(AAGCTTTTTTTTTTTA)H?T11C(AAGCTTTTTTTTTTTC)H?T11G(AAGCTTTTTTTTTTTG)大小/bpSize類型Type大小/bpSize類型Type大小/bpSize類型TypeAP1(TACAACGAGG)250下調(diào)AP2(TGGATTGGTC)AP3(CTTTCTACCC)AP4(TTTTGGCTCC)400上調(diào)AP5(GGAACCAATC)650下調(diào)350下調(diào)250下調(diào)AP6(AAACTCCGTC)750上調(diào)AP7(TCGATACAGG)500上調(diào)AP8(TGGTAAAGGG)AP9(TCGGTCATAG)250下調(diào)AP10(GGTACTAAGG)500下調(diào)AP11(TACCTAAGCG)300下調(diào)500下調(diào)AP12(CTGCTTGATG)250下調(diào)AP13(GTTTTCGCAG)400下調(diào)AP14(GATCAAGTCC)300上調(diào)250下調(diào)AP15(GATCCAGTAC)800下調(diào)AP16(GATCACGTAC)AP17(GATCTCAGAC)AP18(GATCATAGCC)250下調(diào)AP19(GATCTAACCG)AP20(GATCGCATTG)300上調(diào)AP21(GATCTGACTG)AP22(GATCATGGTC)600下調(diào)AP23(GATCATAGCG)300下調(diào)AP24(GATCTAAGGC)400上調(diào)

表4 差異表達(dá)片段Blast分析結(jié)果

Table 4 Blast analysis of differentially expressed fragments

差異片段Number同源基因Homologousgene片段大小/bpSize序列號(hào)AccessionNo．基因功能Genefunction表達(dá)模式Type1Proteinlin?54homolog(LIN54)510AC＿000163．1有絲分裂相關(guān)基因的活化下調(diào)2Krueppel?likefactor12(KLF12)375AC＿000169．1細(xì)胞增殖和凋亡下調(diào)

通過DDRT法篩選到2個(gè)差異表達(dá)基因，KLF12屬于Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Kruppel-like factors，KLF)家族。KLF家族是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，在真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中起著重要作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等多種生命活動(dòng)。目前，KLF12與腫瘤相關(guān)的研究比較多，而與應(yīng)激相關(guān)的研究未見報(bào)道。但體內(nèi)和體外試驗(yàn)證明，同一家族的KLF11基因能使氧化應(yīng)激基因SOD2和CAT1的表達(dá)下調(diào)，增加了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性[27]。而冷應(yīng)激可以誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)自由基增多，對(duì)機(jī)體造成損傷。也有研究報(bào)道稱KLF11在小鼠肝臟的糖代謝過程中起著重要作用[28]，而糖代謝又是為機(jī)體提供能量的主要途徑，與冷應(yīng)激后機(jī)體維持體溫恒定密切相關(guān)，但具體的機(jī)理仍待進(jìn)一步的研究。而同家族的另一成員KLF4，能夠與HSPs基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合可直接調(diào)控HSPs的基礎(chǔ)表達(dá)，在小鼠熱休克反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)[29]，提示KLF12可能參與動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。而LIN54屬于LINC家族(人源的LINC家族也稱DREAM)，LINC家族是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種新的E2F-口袋蛋白復(fù)合體，在靜止期細(xì)胞和有絲分裂基因的活化中起重要作用[30-32]。LIN54是LINC的一個(gè)重要的家族成員，在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要的作用，LIN54富含半胱氨酸的CXC結(jié)構(gòu)域是連接cdc2啟動(dòng)子的新型DNA結(jié)合區(qū)域，在cdc2啟動(dòng)子處發(fā)現(xiàn)了LIN54的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的同源區(qū)域重疊。在冷應(yīng)激環(huán)境中，細(xì)胞活性降低，因?yàn)長(zhǎng)IN54與細(xì)胞周期進(jìn)程高度相關(guān)，推測(cè)其在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

A.兩個(gè)冷應(yīng)激前后差異表達(dá)片段銀染結(jié)果：BC.冷應(yīng)激前；AC.冷應(yīng)激后。B.兩個(gè)冷應(yīng)激前后差異表達(dá)片段的熒光定量PCR結(jié)果：**代表差異極顯著(P<0.01)；*代表差異顯著(P<0.05)A.Silver staining map of 2 fragments differentially displayed before and after cold stress：BC.Before cold stress；AC.After cold stress.B.RT-qPCR results of 2 differentially expressed before and after cold stress：** means very significant difference(P<0.01)；* means significant difference(P<0.05)圖1 兩個(gè)冷應(yīng)激前后差異表達(dá)片段Fig.1 Two fragments differentially expressed before and after cold stress

本研究所用樣品來自內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)的三河牛，牛本身作為一種大型的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在試驗(yàn)處理和樣本的采集過程中存在許多局限性。在對(duì)三河牛冷應(yīng)激研究的過程中，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)個(gè)體的體重、月齡、個(gè)體血樣采集中的反應(yīng)等都可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響，而且無法采集參與冷應(yīng)激調(diào)控體系中的重要組織樣本，不能比較參與組織與血液應(yīng)對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)的基因表達(dá)及各生化指標(biāo)的差異，不能連續(xù)追蹤冷應(yīng)激不同時(shí)間內(nèi)基因表達(dá)及各生化指標(biāo)的變化趨勢(shì)等問題，使得對(duì)牛等大型動(dòng)物的冷應(yīng)激研究存在許多不確定性，為了克服這些問題，本課題組下一步準(zhǔn)備先采用模式動(dòng)物(小鼠或大鼠)和細(xì)胞模型，精確控制所有試驗(yàn)條件，檢測(cè)不同時(shí)間及不同強(qiáng)度的冷應(yīng)激條件下基因的表達(dá)差異及生化指標(biāo)的變化，篩選與冷應(yīng)激相關(guān)的生化指標(biāo)和基因，然后再對(duì)牛群中對(duì)應(yīng)的冷應(yīng)激相關(guān)基因進(jìn)行分析和驗(yàn)證。盡管存在諸多問題，本研究首次從分子水平及生化指標(biāo)2個(gè)方面同時(shí)進(jìn)行牛的冷應(yīng)激研究，后期的工作將擴(kuò)大群體進(jìn)一步驗(yàn)證及分析篩選到的差異表達(dá)基因及檢測(cè)到的生化指標(biāo)，尋找能夠評(píng)價(jià)牛冷應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的標(biāo)志物，研究牛冷應(yīng)激反應(yīng)的分子遺傳機(jī)制。

[1] 孫 燕，柳鋒霖，宋耿青，等.急性和慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性和神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].中華消化雜志，2006，26(1)：38-41. SUN Y，LIU F L，SONG G Q，et al.Effects of acute and chronic restraint stress on visceral sensitivity and neuroendocrine response in rats[J].ChineseJournalofDigestion，2006，26(1)：38-41.(in Chinese)

[2] 李士澤，楊玉英，楊煥民，等.急性冷暴露和冷習(xí)服對(duì)大鼠和雛雞某些內(nèi)分泌活動(dòng)影響的比較生理學(xué)研究[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24(1)：23-24. LI S Z，YANG Y Y，YANG H M，et al.Comparative physiology research of acute cold exposure and cold acclimation to the certain endocrine activity in rats and chicks[J].TheChineseJournalofAppliedPhysiology，2008，24(1)：23-24.(in Chinese)

[3] FUKUHARA K，KVETNANSKY R，CIZZA G，et al.Interrelations between sympathoadrenal system and hypothalamo-pituitary-adrenocortical/thyroid systems in rats exposed to cold stress[J].JNeuroendocrinol，1996，8(7)：533-541.

[4] 王建鑫，王 安.急性冷應(yīng)激對(duì)金定鴨開產(chǎn)前內(nèi)分泌活動(dòng)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005，36(4)：480-485. WANG J X，WANG A.Study on the effect of acute cold stress on incretion activity in pre-egged Jin-ding ducks in cage[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity，2005，36(4)：480-485.(in Chinese)

[5] PAJOVIC S B，PEJIC S，STOJILJKOVIC V，et al.Alterations in hippocampal antioxidant enzyme activities and sympatho-adrenomedullary system of rats in response to different stress models[J].PhysiolRes，2006，55：453-460.

[7] 曹靖寶，于宏敏.紅細(xì)胞鉀作為中國(guó)荷斯坦牛耐寒性選擇遺傳標(biāo)記物的可靠性研究[J].中國(guó)奶牛，1997 (6)：26-28. CAO J B，YU H M.Reliability research about erythrocyte potassium as the selected genetic markers of Chinese Holstein cow cold resistance[J].ChinaDairyCattle，1997(6)：26-28.(in Chinese)

[8] WANG J W，XU S W.Effects of cold stress on the messenger ribonucleic acid levels of corticotrophin-releasing hormone and thyrotropin-releasing hormone in hypothalami of broilers[J].PoultSci，2008，87(5)：973-978.

[9] WANG J T，LI S，LI J L，et al.Effects of cold stress on the messenger ribonucleic acid levels of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in spleen，thymus，and bursa of fabricius of chickens[J].PoultSci，2009，88(12)：2549-2554.

[10] 李忠秋，劉春龍，馬 紅，等.冷應(yīng)激對(duì)東北野豬成纖維細(xì)胞HSP90 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(12)：1978-1983. LI Z Q，LIU C L，MA H，et al.Influence of cold stress on transcription ofHSP90 in northeast wild boar fibroblasts[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(12)：1978-1983.(in Chinese)

[11] 李士澤，任寶波，楊煥民，等.不同強(qiáng)度冷應(yīng)激對(duì)大鼠肌肉、脾臟和肝臟中 HSP70 表達(dá)的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，12(2)：235-238. LI S Z，REN B B，YANG H M，et al.The effects of different intensity of cold stress on the expression of HSP70 in rat muscle，spleen and liver[J].ChineseJournalofApplied&EnvironmentalBiology，2006，12(2)：235-238.(in Chinese)

[12] 吳永魁，計(jì) 紅，胡仲明，等.不同強(qiáng)度冷應(yīng)激對(duì)仔豬應(yīng)激激素和 HSP70 的影響[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)[C]，2008：871-872. WU Y K，JI H，HU Z M，et al.The effects of different intensity of cold stress on stress hormones and HSP70 in piglet[A].China Animal Husbandry and Veterinary Association Animal Epidemiology Branch of the Third Conference on Swine Disease Prevention and Control[C]，2008：871-872.(in Chinese)

[13] 金福厚，龐 巖，李士澤，等.BALB/C 鼠睪丸組織中冷誘導(dǎo) RNA 結(jié)合蛋白的 cDNA 克隆與序列分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009，15(1)：87-90. JIN F H，PANG Y，LI S Z，et al.CDNA cloning and sequence analysis of cold-induced RNA binding protein in BALB/C mice testicular tissue[J].ChineseJournalofApplied&EnvironmentalBiology，2009，15(1)：87-90.(in Chinese)

[14] 谷愛梅，董兆申，鄧欣珠.金屬硫蛋白與細(xì)胞耐寒力的關(guān)系[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1999，17(5)：272-275. GU A M，DONG Z S，DENG X Z.Relationship between metallothionein and cold tolerance of cells[J].ChineseJournalofIndustrialHygieneandOccupationalDiseases，1999，17(5)：272-275.(in Chinese)

[15] 李文雍，陳清軒.mRNA 差異顯示技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，12(5)：597-601. LI W Y，CHEN Q X.Progress in the technique of mRNA differential display[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2004，12(5)：597-601.(in Chinese)

[16] 安 健，汪 明，王黎霞，等.mRNA 差異顯示 PCR 的研究進(jìn)展[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2)：64-68. AN J，WANG M，WANG L X，et al.mRNA differential display and its application on drug-resistance of coccidia[J].JournalofBeijingAgriculturalCollege，2005，20(2)：64-68.(in Chinese)

[17] HAAG E，RAMAN V.Effects of primer choice and source ofTaqDNA polymerase on the banding patterns of differential display RT-PCR[J].Biotechniques，1994，17(2)：226-228.

[18] LIANG P，PARDEE A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J].Science，1992，257(5072)：967-971.

[19] STEINAU M，RAJEEVAN M S.RNA profiling in peripheral blood cells by fluorescent differential display PCR[M].MethodsMolBiol，2009：211-222.

[20] SHEN M M.Identification of differentially expressed genes in mouse development using differential display andinsituhybridization[J].Methods，2001，24(1)：15-27.

[21] BAUER D，MUULLER H，REICH J，et al.Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR)[J].NucleicAcidsRes，1993，21(18)：4272-4280.

[22] 盧振峰，劉莉莉，趙國(guó)麗，等.三河牛DGAT1 基因 K232A 位點(diǎn)與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].中國(guó)奶牛，2014(3)：13-16. LU Z F，LIU L L，ZHAO G L，et al.Association of K232A in DGAT1 gene with milk production traits in Sanhe cattle[J].ChinaDairyCattle，2014(3)：13-16.(in Chinese)

[23] 馬秋萌，秦春華，吳宏軍，等.三河牛目標(biāo)性狀邊際效益研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47(7)：1409-1416. MA Q M，QIN C H，WU H J，et al.Study on marginal profits of traits in the breeding goal in Sanhe cattle[J].ScientiaAgriculturaSinica，2014，47(7)：1409-1416.(in Chinese)

[24] 吳宏軍，馬孝林，劉愛榮，等.內(nèi)蒙古三河牛培育歷程及進(jìn)展[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2012，38(4)：48-52. WU H J，MA X L，LIU A R，et al.Breeding history and current improvements of Sanhe cattle in Inner Mongolia[J].ChinaCattleScience，2012，38(4)：48-52.(in Chinese)

[25] 吳永魁.仔豬冷應(yīng)激反應(yīng)中激素、HSP70 及其 mRNA 的動(dòng)態(tài)分析[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2006. WU Y K.Dynamic analysis of hormones，HSP70 and HSP70 mRNA during piglets cold stress[D].Changchun：Jilin University，2006.(in Chinese)

[26] SASAKI F，WU P，ROUGEAU D，et al.Cytochemical studies of responses of corticotropes and thyrotropes to cold and novel environment stress[J].Endocrinology，1990，127(1)：285-297.

[27] FERNANDEZ-ZAPICO M E，MLADEK A，ELLENRIEDER V，et al.An mSin3A interaction domain links the transcriptional activity ofKLF11 with its role in growth regulation[J].EMBOJ，2003，22(18)：4748-4758.

[28] 章華兵.KLF11作為一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)小鼠肝臟脂代謝的分子機(jī)制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2012. ZHANG H B.Mouse KLF11 is a key mediator of hepatic lipid metabolism[D].Beijing：Peking Union Medical College，2012.(in Chinese)

[29] 劉 瑛.KLF4：一個(gè)熱休克反應(yīng)和熱休克蛋白表達(dá)的新調(diào)控介質(zhì)[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2006. LIU Y.KLF4，a new regulate mediator of heat shock response and heat shock protein[D].Changsha：Central South University，2006.(in Chinese)

[30] LITOVCHICK L，SADASIVAM S，F(xiàn)LORENS L，et al.Evolutionarily conserved multisubunit RBL2/p130 and E2F4 protein complex represses human cell cycle-dependent genes in quiescence[J].MolCell，2007，26(4)：539-551.

[31] SCHMIT F，KORENJAK M，MANNEFELD M，et al.LINC，a human complex that is related to pRB-containing complexes in invertebrates regulates the expression ofG2/Mgenes[J].CellCycle，2007，6(15)：1903-1913.

[32] PILKINTON M，SANDOVAL R，COLAMONICI O R.Mammalian Mip/LIN-9 interacts with either the p107，p130/E2F4 repressor complex or B-Myb in a cell cycle-phase-dependent context distinct from theDrosophiladREAM complex[J].Oncogene，2007，26(54)：7535-7543.

(編輯 郭云雁)

Effects of Severe Cold Stress on Blood Biochemical Parameters and Related Gene Expression in Sanhe Cattle

LI Wei1,3，LIU Rui1，MA Yao2，LI Jin-long2，WU Hong-jun4，LIU Ai-rong5， YU Ying1，XU Qing2，WANG Ya-chun1*

(1.KeyLaboratoryofAgriculturalAnimalGeneticsandBreeding，NationalEngineeringLaboratoryofAnimalBreeding，CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.InstituteofBiologicalScienceandBioengineering，BeijingJiaotongUniversity，Beijing100044，China；3.SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；4.InnerMongoliaXieertalaCattleBreedingFarm，Hailaer021008，China； 5.InnerMongoliaHailaerAgriculturalReclamationGroup，Hailaer021008，China)

The aim of this study was to detect the biochemical indexes and relevant genes related to cold stress in Sanhe cattle.Thirty heifer Sanhe cattle in Inner Mongolia were kept at -32 ℃ for 3 h，and then blood samples were collected before and after cold stress separately to detect the biochemical indexes and gene expression changes.After 3 h cold stress，T3，T4 and ACTH in blood significantly increased (P<0.01).The expressions ofLIN54 andKLF12 decreased in silver staining map produced by mRNA differential display method (DDRT)，decrease of the 2 genes expression were further verified at the level ofP<0.05 forLIN54 andP<0.01 forKLF12 by fluorescence quantitative RT-PCR.The 2 genes belonged to LINC and KLF families，respectively,LINC involved in mitotic gene activation,KLF involved in cell proliferation and apoptosis.T3，T4 and ACTH may be used as the candidate indexes to measure the strength of cold stress in large population，LIN54 andKLF12 may be the important candidate genes for further study on genetic mechanism of cold stress in cattle.The combination of these biochemical indexes and expression change of candidate genes would be used to assess the change of individual under cold stress，which will be more valuable in breeding for cold resistance ability in Sanhe cattle.

cold stress；Sanhe cattle；biochemical index；gene expression；mRNA differential display

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.024

2014-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172191)；“十二五”科技支撐計(jì)劃(2011BAD28B02)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-37)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1191)

李 瑋(1990-)，女，河北邢臺(tái)人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子遺傳學(xué)研究，E-mail：lw9056@163.com；劉 蕤(1988-)，女，四川宜賓人，碩士，主要從事動(dòng)物分子數(shù)量遺傳學(xué)研究，E-mail：kkrabbit-2007@163.com。李 瑋和劉 蕤為共同第一作者

*通信作者：王雅春，教授，E-mail：wangyachun@cau.edu.cn

S823.2

A

0366-6964(2015)08-1463-08