兩種施肥處理下不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土微生物群落結(jié)構(gòu)PLFA分析

陳一民，隋躍宇，劉曉冰，侯 萌，張興義

(中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

0 引 言

土壤微生物是土壤有機質(zhì)的重要分解者，也是驅(qū)動農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分循環(huán)的主要貢獻(xiàn)者[1]。土壤有機質(zhì)是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的碳庫[2]，其含量、活性組分和結(jié)構(gòu)都會對土壤微生物群落產(chǎn)生較大的影響[3-5]。我國東北黑土區(qū)有機質(zhì)含量變化范圍較大，約6.5～128.9 g·kg-1[6]，有機質(zhì)含量的差異是影響黑土區(qū)土壤微生物群落的主要因素之一；同時隨著有機質(zhì)含量的變化，土壤有機質(zhì)組分特征[7-8]也會發(fā)生較大的變異，這將對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生直接的影響。

施肥是最重要的農(nóng)業(yè)措施之一，近年來由于化肥投入量過大，已經(jīng)導(dǎo)致了嚴(yán)重的黑土退化，以及土壤生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化[9]。但是，化肥對土壤微生物群落組成的影響目前尚無一致的報道，有研究認(rèn)為化肥會顯著改變微生物群落結(jié)構(gòu)[10-12]，但也有報道中提及長期施用化肥后土壤微生物群落趨于穩(wěn)定，對施用化肥的響應(yīng)變?nèi)鮗13-14]。因此，研究有機質(zhì)含量和施肥對黑土微生物群落結(jié)構(gòu)的綜合影響十分必要。

氣候條件、種植及管理模式等也是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，但區(qū)域尺度研究很難將有機含量對土壤微生物群落的影響從諸多因素中分離開來[4-5]；同時，傳統(tǒng)肥料試驗一般只關(guān)注施肥對特定土壤中微生物群落的影響[9]，這些弊端極大限制了我們認(rèn)識有機質(zhì)含量和施肥在決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中的重要作用。因此，本研究利用空間移位方法，將不同有機質(zhì)含量的農(nóng)田黑土置于相同氣候條件下，采用相同的種植模式和田間管理措施來消除氣候等因子的差異，系統(tǒng)地研究了有機質(zhì)含量和施肥對農(nóng)田黑土微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在深化對有機質(zhì)含量-施肥-土壤微生物群落結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

試驗地位于東北典型黑土帶中部的中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實驗站(N47°27′，E126°56′)，氣候類型為溫帶大陸季風(fēng)氣候，年平均氣溫1.5 ℃，年降水量500～600 mm，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨。年有效積溫約2 400 ℃，年均日照時數(shù)約2 700 h，無霜期約120 d，地下水埋深在10～20 m之間。

1.2 試驗設(shè)計

試驗始于2004年，在黑土區(qū)采集有機質(zhì)含量16.6 g·kg-1(SOM1.7)、32.2 g·kg-1(SOM3)、50.6 g·kg-1(SOM5)、58.6 g·kg-1(SOM6)和108.9 g·kg-1(SOM11)5個有機質(zhì)含量的農(nóng)田黑土，通過空間移位的方法運至中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實驗站，按原層次分別置入各個的微區(qū)中。微區(qū)規(guī)格為1.4 m長×1.2 m寬×1 m深。微區(qū)間用磚墻隔開，高出地表20cm，內(nèi)側(cè)貼防水布防止不同微區(qū)間相互影響。試驗設(shè)施肥(NPK)和不施肥(CK)兩個處理，每個處理3次重復(fù)。每年5月初種植玉米，施肥處理中基肥施肥量為N 90 kg·hm-2，P2O575 kg·hm-2，K2O 60 kg·hm-2；在玉米大喇叭口期追施肥量為 N 60 kg·hm-2[15]。

1.3 土壤樣品采集與預(yù)處理

土壤樣品于2016年10月8日玉米收獲后采集。用土鉆采沿“S”型在各個小區(qū)內(nèi)均勻采集0～20 cm 土樣，取5-7個點混成一個樣。混合的土樣裝入封口聚乙烯袋，置于保鮮盒中帶回實驗室，進(jìn)行處理。取回的土樣在-80℃條件下冰箱保存，于測定磷脂脂肪酸前采用冷凍干燥機凍干。

1.4 土壤磷脂脂肪酸的提取與分析

土壤磷脂脂肪酸的提取參照Frostegard的方法進(jìn)行[16]。稱取冷凍干燥的3.00g土壤樣品于離心管中，使用氯仿-甲醇-檸檬酸單相提取劑(體積比為1∶2∶0.8)提取兩次后進(jìn)行洗脫，之后加入KOH甲醇溶液進(jìn)行甲脂化，甲脂化完成后用正己烷萃取磷脂脂肪酸甲脂，并用氮氣吹干。將得到的脂肪酸甲脂樣品溶于60 μL的正己烷，通過帶有MIDI峰識別軟件氣相色譜測定。

如表1所示，根據(jù)不同的磷脂脂肪酸標(biāo)記，對樣品中微生物豐度進(jìn)行統(tǒng)計。

表1 微生物磷脂脂肪酸標(biāo)記Table 1 PLFA biomarkers for microbes

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

PLFA含量、PLFA相對豐度等采用SPSS20.0(IBM SPSS Inc.)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計算。采用雙因素方差分析檢測不同施肥處理和不同有機質(zhì)含量之間的差異，采用Turkey′s HSD方法在α=0.05水平上進(jìn)行多重比較。PLFA的NMDS分析采用R軟件(version 3.4.3)的“vegan”包進(jìn)行分析，采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤微生物群落生物量

在5個有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土，整體來看隨土壤有機質(zhì)含量的增加，總微生物量呈增加趨勢(圖1)。在施肥處理中SOM1.7、SOM3、SOM5、SOM6和SOM11土壤總生物量顯著高于不施肥處理土壤總微生物量，增加幅度為9%～77%(P<0.05)。細(xì)菌生物量的變化趨勢與總生物量類似(圖2)，整體來看細(xì)菌生物量隨有機質(zhì)含量升高而增多，除SOM5外，施肥均能顯著提高農(nóng)田黑土土壤細(xì)菌的生物量，提高幅度為16%～113%(P<0.05)。革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌生物量對土壤有機質(zhì)和施肥的響應(yīng)與細(xì)菌總生物量一致(圖2)。就真菌而言，其生物量也隨有機質(zhì)含量增加而增加，但是施肥僅顯著增加了SOM3中的真菌生物量，對其他有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤真菌生物量的影響不顯著(圖2)。

注：不同字母代表兩種施肥條件下五個有機質(zhì)間在0.05水平上差異達(dá)到顯著。下同。Note: Different letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.The same is as below.圖1 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤磷脂脂肪酸總量Fig.1 Total PLFAs in Mollisols with different organic matter contents

圖2 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌磷脂脂肪酸標(biāo)志物含量Fig.2 Bacterial,fungal,gram-positive bacterial and gram-negative bacterial PLFAs in Mollisols with different organic matter contents

2.2 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤微生物相對豐度

就相對豐度而言，其變化規(guī)律與生物量的變化規(guī)律不同(表2)。在兩種施肥處理中，5個有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土間真菌相對豐度無顯著差異，但整體來看，施肥處理中各有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤真菌的相對豐度要略低于不施肥處理。細(xì)菌相對豐度先隨有機質(zhì)含量增加而增加，在SOM5或SOM6中達(dá)到最高，之后在SOM11中發(fā)生明顯的下降；施肥能夠增加各有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤細(xì)菌的相對豐度。在SOM1.7、SOM3、SOM5、SOM6和SOM11中，兩種施肥處理中革蘭氏陽性細(xì)菌的相對豐度無明顯差異，整體來看，施肥后革蘭氏陽性細(xì)菌的相對豐度略有提升。革蘭氏陰性細(xì)菌的相對豐度在不施肥處理中SOM3中最高，在施肥處理SOM3中最低，但在相同施肥處理下的5個有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土差異不大；整體來看，施肥后革蘭氏陰性細(xì)菌的相對豐度略有下降。真菌/細(xì)菌比在本研究中無顯著差異，但整體上施肥后真菌/細(xì)菌比值略有降低，這主要是由于施肥后真菌相對豐度有所下降，但細(xì)菌相對豐度有所升高所引起的。在同一施肥處理中，G+/G-比值在5個有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土無顯著差異；但是施肥處理中G+/G-比值略高于不施肥處理，這主要是由于施肥增加G+相對豐度但卻降低G-相對豐度所引起的。

表2 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤微生物相對豐度Table 2 Relative abundance of microbes in Mollisols with different organic matter contents

2.3 不同有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過對PLFA進(jìn)行NMDS分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田黑土土壤有機質(zhì)含量和施肥均會影響土壤微生物群落組成(圖3)。在NMDS圖譜中，相同施肥條件下每個有機質(zhì)含量的農(nóng)田黑土3次重復(fù)都聚在一起，說明本研究中微生物群落結(jié)構(gòu)樣品重復(fù)性較好。如圖3中橢圓所示，基于Bray-curtis距離，從NMDS圖譜發(fā)現(xiàn)沿NMDS1方向不施肥處理與施肥處理中微生物群落結(jié)構(gòu)的明顯分開。在不施肥處理中，各有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土間微生物群落結(jié)構(gòu)明顯與其他分開；但在施肥處理中除5個有機質(zhì)含量農(nóng)田黑土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)很難分開，這說明施肥會削弱土壤有機質(zhì)含量對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。由NMDS圖譜也能發(fā)現(xiàn)，隨著有機質(zhì)含量的升高，不施肥處理與施肥處理中微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性也增強，這說明有機質(zhì)含量升高會幫助微生物群落在外界干擾條件下保持一定的穩(wěn)定性。

圖3 NMDS分析圖譜Fig.3 NMDS analysis

3 討 論

本研究中，有機質(zhì)含量和施肥對PLFA總量、細(xì)菌PLFA量、真菌PLFA量、G+PLFA量、G-PLFA量和微生物群落組成均產(chǎn)生了較大的影響。隨著有機質(zhì)含量的升高，土壤微生物可利用碳源量增加，這可能是導(dǎo)致土壤PLFA總量、細(xì)菌PLFA量和真菌PLFA量增加的直接原因[17-18]。施肥也能引起土壤PLFA總量、細(xì)菌PLFA量和真菌PLFA量顯著增加，這與之前的研究結(jié)果相同[3,19]，這主要是由于施肥后為微生物的生長繁殖提供養(yǎng)分，尤其是氮素，直接促進(jìn)土壤微生物的生長[20]。但也有研究指出，長期施用化肥會使土壤酸化、板結(jié)，通氣性降低，改變了土壤物理性狀，抑制了土壤微生物的生命活動，同時由于無外源有機碳源補充，隨著作物生長對土壤碳素的大量消耗，使得土壤有機碳含量逐漸減少，迫使土壤微生物將其體內(nèi)固持的碳素釋放出來以供作物利用，進(jìn)而顯著降低了土壤微生物量[21]。施肥對土壤微生物量的影響主要是由于土壤類型不同所造成的，黑土有機質(zhì)含量高，鹽基離子豐富，緩沖能力較強，施用化肥所帶來的的負(fù)面效應(yīng)可被緩沖，在養(yǎng)分源充足的情況下，微生物迅速繁殖。綜上，可通過調(diào)節(jié)黑土有機質(zhì)含量和適量施肥來改變微生物量，促進(jìn)黑土養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，提升黑土質(zhì)量。

就微生物群落結(jié)構(gòu)而言，本研究中5個有機質(zhì)含量農(nóng)田中細(xì)菌相對豐度、真菌相對豐度、真菌/細(xì)菌比及G+/G-比在相同施肥處理中幾乎無變化。這主要是是由于細(xì)菌、真菌、G+細(xì)菌、G-細(xì)菌及總微生物量均隨土壤有機質(zhì)含量的增加而增加，這種同步增加的趨勢導(dǎo)致真菌、細(xì)菌、G+細(xì)菌和G-細(xì)菌的相對豐度變化不大，進(jìn)而造成真菌/細(xì)菌比值、G+/G-細(xì)菌比值變化也不大。已有研究表明，施用化肥后微生物群組的相對豐度可能會增加[22]，可能會減少[10]，也有可能會保持不變[17]。但是，選擇哪種分類水平來表征土壤微生物群落變化一直是十分重要的問題[23-24]。由于PLFA技術(shù)中分類能力有限，很難確定具體某種微生物的豐度變化。因此，將來需要更詳盡的分類水平來研究施肥對微生物相對豐度的影響。

NMDS分析發(fā)現(xiàn)，有機質(zhì)含量與施肥是影響農(nóng)田黑土微生物群落組成的重要因素。土壤有機質(zhì)含量是決定土壤細(xì)菌多樣性的首要因素[5]，并且是真菌空間分布格局的主導(dǎo)因素[4]，因為土壤中絕大多數(shù)的微生物，依賴于分解土壤有機質(zhì)來獲取能量[22]。已有很多研究證實施用化肥會引起土壤微生物群落組成[10,12]]。本研究中，長期施用化肥能顯著改變微生物群落組成，這是由于微生物群落組成對N、P和K肥料的施用敏感所造成的[25]；此外，微生物對肥料的敏感性可能也是造成本研究中施肥處理下有機質(zhì)含量對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響受到削弱的原因。

空間移位方法是消除氣候條件、種植、管理模式及施肥差異等因素的有效研究方法。短期空間移位后，土壤類型是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子，土壤微生物群落對環(huán)境條件的改變具有一定的抵抗力[26]；隨著時間的推移，空間移位后土壤微生物群落與原始位點土壤微生物群落朝不同方向發(fā)生演替[27]，但土壤類型仍是決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的最重要因素[28]。本研究是在空間移位12年后開展的，5個黑土本身性質(zhì)對微生物群落仍具有十分顯著的影響，這也進(jìn)一步說明了土壤類型在決定微生物群落中的重要作用。本研究中未進(jìn)行原位樣點與移位后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異的分析，以后的研究中應(yīng)著重進(jìn)行移位后與原位樣點間微生物群落結(jié)構(gòu)差異的分析，在排除土壤類型的影響后明確氣候條件對微生物群落的影響。

4 結(jié) 論

(1)有機質(zhì)含量升高和施肥會顯著提高農(nóng)田黑土總微生物量、細(xì)菌生物量、真菌生物量、革蘭氏陽性細(xì)菌生物量和革蘭氏陰性細(xì)菌生物量；

(2)有機質(zhì)含量對農(nóng)田黑土真菌/細(xì)菌比值和革蘭氏陽性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌比無顯著影響，但施肥后革蘭氏陽性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌比略有升高，真菌/細(xì)菌比值無顯著變化。

(3)有機質(zhì)含量和施肥是影響農(nóng)田黑土微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，并且施肥可能會在一定程度上掩蓋有機質(zhì)對微生物群落的影響。