新疆地區(qū)婦女宮頸感染人乳頭瘤病毒16型E1、E2的遺傳變異分析

王露月，王芳，付少偉，張春賀，劉依萌，者湘漪,，李洪濤，李冬妹，潘澤民*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，天津 300070；3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

宮頸癌是全世界最常見的癌癥之一，在女性中的發(fā)病率和病死率僅次于乳腺癌[1]。中國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和病死率穩(wěn)步下降。然而，在新疆維吾爾自治區(qū)等一些邊遠(yuǎn)貧困地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率和病死率仍然很高[2]。新疆地區(qū)HPV陽性率為14.02%，且多為HPV16、HPV18、HPV52和HPV53[3]。

持續(xù)性高危型HPV感染可能導(dǎo)致癌前病變，如果不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，其中一部分會(huì)發(fā)展成浸潤(rùn)性癌[4]。按照HPV病毒進(jìn)化學(xué)分類，該病毒的天然遺傳變異通常分為A、B、C、D 4個(gè)主要變異譜系，A譜系:歐洲原型EUR(A1-A3)、亞洲型As(A4)，B譜系：非洲Ⅰ型(AF-1)，C譜系：非洲Ⅱ型(AF-2)，D譜系：亞-美型(AA)和北美型(NA)[5]。新疆婦女HPV16的感染率較高，且多為歐洲株[6-7]。HPV16 E1、E2蛋白在HPV感染宿主細(xì)胞過程中承擔(dān)著重要的角色。HPV16 E1和E2可調(diào)節(jié)病毒基因組復(fù)制[8]。HPV E1是最保守的蛋白質(zhì)之一，在啟動(dòng)HPV DNA復(fù)制中起著核心作用。HPV E2蛋白是病毒生命周期中的關(guān)鍵蛋白，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制啟動(dòng)和病毒基因組分割等方面具有重要的功能[9]。其結(jié)構(gòu)類似于典型的轉(zhuǎn)錄因子，具有一個(gè)反式激活域和一個(gè)羧基末端DNA結(jié)合域，由可變鉸鏈區(qū)隔開[10]。在DNA復(fù)制的起點(diǎn)，E2與HPV E1復(fù)制解旋酶相互作用，促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制[11]。HPV E1的變異可導(dǎo)致病毒增強(qiáng)原代細(xì)胞的永生化能力[12]。HPV16病毒E2結(jié)構(gòu)的缺失在HPV16陽性腫瘤的患者中具有更差的臨床結(jié)果[13]。

HPV16 E1和E2核苷酸位點(diǎn)的變異與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)[14-15]。因此，分析新疆地區(qū)的女性宮頸癌的基因多態(tài)性有助我們更好地理解HPV基因變異與宮頸癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集

收集新疆伊犁洲友誼醫(yī)院、喀什人民醫(yī)院和新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院宮頸病變婦女宮頸粘液脫落細(xì)胞，共獲得80例HPV16感染陽性樣本并得到所有患者的知情同意。所有患者均無長(zhǎng)期居住在外地的病史。樣品于-80 ℃低溫冰箱中儲(chǔ)存。

1.2 樣本的DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用上海生工基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA，提取后的DNA儲(chǔ)存于-20 ℃保存。用1%瓊脂糖電泳對(duì)1 μL DNA樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查并估計(jì)濃度，然后將樣本稀釋到工作濃度10～20 ng·μL-1。反應(yīng)混合物(20 μL)包括1×GC緩沖液I(TAKARA)，Mg2 +2.5 mmol·L-1，dNTP 0.2 mmol·L-1，每種引物各0.2 μmol·L-1，1 U HotStarTaq聚合酶(TAKARA)和1 μL模板DNA。反應(yīng)溫度為95 ℃ 2 min；11個(gè)周期×(94 ℃ 20 s，62 ℃-0.5 ℃/周期40 s，72 ℃ 1 min)；24個(gè)周期×(94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃ 2 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物可存放于4 ℃冰箱中。PCR引物信息詳見表1。

表1 引物信息

1.3 測(cè)序

測(cè)序由上海天昊科技有限公司進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)SAP(Promega)和EXO I(Epicentre)純化，將0.5U SAP和4U Exo I添加到8 μL PCR產(chǎn)物中，混合物孵育37 ℃ 60 min，75 ℃ 15 min。最后用ABI 公司的Big- Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，并經(jīng)酒精純化后再在DNA分析儀(ABI3130XL)上樣測(cè)序。測(cè)序引物為表1中的 E-1R:5′-ACTGCAACCACCCCCACT-3′,E-2R:5′-ATCCATTCTGGCGTGTCTCC-3′,E-3F:5′-TCATGGGGAATGGTTGTGTT-3′,E-4F:5′-GGTGATTGGAAGCAAATTGTTATG-3′,E-5R:5′-CCCGCATGAACTTCCCATAC-3′,E-6F:5′-GAAGCATCAGTAACTGTGGTAGAGG-3′。

1.4 HPV16變異株的進(jìn)化學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果使用Polyphred軟件分析單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，與HPV16歐洲標(biāo)準(zhǔn)株(GenBank：NC_001526.2)進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)與其他典型HPV變異株HQ644283.1(A1),HQ644268.1(A1),HQ644280.1(A1),HQ644282.1(A1),AF536179.1(A2),HQ644236.1(A3),HQ644248.1(A4),HQ644251.1(A4),AF534061.1(A4),HQ644235.1(A4),HQ644240.1(B1),HQ644290.1(B1),HQ644238.1(B1),HQ644298.1(B3),HQ644237.1(C),HQ644239.1(C),HQ644249.1(C),HQ644250.1(C),AF472509.1(C),HQ644257.1(D1),HQ644279.1(D2),HQ644281.1(D2),HQ644263.1(D2),HQ644277.1(D2),HQ644247.1(D3),HQ644253.1(D3),HQ644255.1(D3),AF402678.1(D3)進(jìn)行比對(duì)。進(jìn)化樹通過MEGA7軟件構(gòu)建。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HPV16 E1、E2基因的每個(gè)變異頻率通過直接計(jì)數(shù)確定。進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以確定HPV16E1、E2變異和宮頸癌之間的關(guān)聯(lián)。

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 17.0進(jìn)行。P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E1、E2基因的突變分析

HPV16 E1、E2基因突變分析共對(duì)80例HPV16 感染陽性的DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，用HPV16原型(歐洲株，GenBank登錄號(hào)：NC_001526.2)作為標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)，多態(tài)性位點(diǎn)如表2、表3所示。

表2 HPV16 E1基因突變和氨基酸的改變

表3 HPV16 E2基因突變和氨基酸的改變

對(duì)于80例HPV16陽性樣本中，在HPV16 E1發(fā)生突變的樣本有34個(gè)，發(fā)生核苷酸突變的位點(diǎn)有25個(gè)(11個(gè)錯(cuò)義突變，14個(gè)同義突變)。以上表格2中顯示HPV16 E1基因突變和氨基酸的改變，錯(cuò)義突變分別為T98C(2/34)、A117C(1/34)、A189C(3/34)、G299A(1/34)、T557C(9/34)、T779C(1/34)、A978G(14/34)、A1068C(2/34)、G1473A(10/34)、C568T(1/34)、A844T(1/34)，氨基酸由異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(I33T)、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?E39D)、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?E63D)、甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?G100E)、異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(I186T)、亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸(L260S)、異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?I326 M)、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?E356D)、甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?M491I)、脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸(P190S)、賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(K282*)。同義突變?yōu)閚t2529(G～A)(1/34)、nt256(C～T)(1/34)、nt531(A～T)(1/34)、nt583(T～C)(1/34)、nt600(T～C)(1/34)、nt651(G～A)(19/34)、nt945(A～G)(1/34)、nt1294(A～C)(1/34)、nt1369(T～C)(1/34)、nt1374(T～G)(1/34)、nt1390(T～C)(5/34)、1480(C～T)(3/34)、nt1683(A～G)(1/34)、nt1731(T～G)(1/34)。另外，在nt510-511之間有一段63個(gè)堿基的插入序列，有5個(gè)樣本在此處發(fā)生了堿基的插入(5/34)。HPV16 E1的同義突變較多，可表明E1蛋白的保守性較好。在HPV16 E1上常見的核苷酸突變位點(diǎn)為A978G、G1473A所對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镮326M、M491I。

在80例HPV16陽性樣本中，HPV16 E2發(fā)生突變的樣本有53個(gè)，發(fā)生核苷酸突變的位點(diǎn)有14個(gè)，(11個(gè)錯(cuò)義突變，3個(gè)同義突變)。以上表格3中顯示HPV16 E2基因突變和氨基酸的改變，核苷酸突變位點(diǎn)分別為G1964A(8/53)、G2204A(4/53)、C2295A(14/53)、G2315A(1/53)、G2385A(9/53)、T2410G(3/53)位于HPV16 E2的反式激活域，氨基酸分別由天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?D25N)、丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(A105T)、蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?T135 K)、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?E142D)、精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?R165Q)、天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?D173E)，還有一處同義突變?yōu)閚t2341(T～C)(1/53)。鉸鏈區(qū)的核苷酸突變?yōu)門2520C(8/53)、C2546T(20/53)、G2585A(6/53)、T2703G(1/53)，氨基酸分別由異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(I210T)、脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸/蘇氨酸(P219S)、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?E232K)、苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(F271V)，還有一處同義突變?yōu)閚t2660(T～C)(4/53)。DNA結(jié)合域的核苷酸突變?yōu)镃2820A(8/53)，氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?T310K)，還有一處同義突變?yōu)閚t2956(T～C)(1/53)。在HPV16 E2上常見的核苷酸突變位點(diǎn)為C2295A、C2546T，所對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)門135K、P219S。

2.2 HPV16 E1和E2核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

HPV16 E1和E2核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析，見圖1。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用N-J 法，并選擇Bootstrap method(1000 replications)和Kimura 2-parameter model構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值>50%表示具有可信度，Bootstrap值>70%表示可信度較高，圖1進(jìn)化樹圖已隱藏Bootstrap值<50%的節(jié)點(diǎn)。由系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果可看出有77個(gè)樣本屬于歐洲株，3個(gè)樣本屬于亞洲株。沒有發(fā)現(xiàn)非洲株和北美/亞裔株。通過對(duì)HPV16變異體的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，樣本15、18、36的變異都與T2410G的突變有關(guān)且均為亞洲株。

圖1 HPV16 E1、E2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.3 病例組和對(duì)照組中基因組HPV16 E1、E2的基因變異

表4顯示了對(duì)照組和病例組中的HPV16 E1基因變異。在HPV16 E1基因序列的分子變異分析中，共觀察到對(duì)照組17個(gè)突變，8個(gè)屬于錯(cuò)義突變，9個(gè)同義突變。在病例組中存在16個(gè)突變，8個(gè)屬于錯(cuò)義突變，8個(gè)同義突變。在病例組和對(duì)照組中，有兩個(gè)位點(diǎn)的變異表明病例組與對(duì)照組之間具有顯著性差異(P<0.05)。分別為T98C和G651A(G651A為同義突變，T98C為錯(cuò)義突變)。表5顯示了HPV16 E2基因變異在對(duì)照組和病例組中的情況。在HPV16 E2基因序列的分子變異分析中，共觀察到對(duì)照組13個(gè)突變，均屬于錯(cuò)義突變。在病例組中存在10個(gè)變異，9個(gè)屬于錯(cuò)義突變，1個(gè)同義突變。未發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組和病例組間具有差異的位點(diǎn)。

表4 病例組和對(duì)照組中基因組HPV16 E1的基因變異

表5 病例組和對(duì)照組中基因組HPV16 E2的基因變異

3 討論

HPV16中部分核苷酸的變異會(huì)影響氨基酸的改變，可能也會(huì)影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而對(duì)宮頸癌的發(fā)展產(chǎn)生影響。大多數(shù)人對(duì)于HPV核苷酸多態(tài)性的研究都集中于E6和E7[6]。而HPVE1和E2基因的變異或缺失會(huì)抑制病毒的轉(zhuǎn)錄活性，并導(dǎo)致E6和E7基因的過度表達(dá)并且激活端粒酶的活性使得細(xì)胞永生化[16]。在HPV16 E1的nt510-511之間有63個(gè)堿基組成的插入序列，該突變體與病毒致癌活性及病毒整合相關(guān)[17]。HPV16 E2 DNA結(jié)合域中的T310 K的變異可能改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，E2蛋白與LCR相互作用，從而導(dǎo)致E6和E7蛋白的表達(dá)增強(qiáng)[18]。E232 K是HPV16As E2鉸鏈區(qū)的連鎖變異，能增強(qiáng)LCR活性的劑量依賴性抑制，會(huì)影響病毒致癌的可能性[19]。位于HPV16 E2反式激活域中的E39A的變異則會(huì)中斷其與E1的相互作用活性和復(fù)制功能，但不影響E2的轉(zhuǎn)錄激活[20]。

由系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果可看出80例HPV陽性樣本中，有77個(gè)樣本屬于歐洲株，3個(gè)樣本屬于亞洲株。沒有發(fā)現(xiàn)非洲株和北美/亞裔株。在HPV16 E1上常見的核苷酸突變位點(diǎn)為A978G和G1473A，所對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镮326 M和M491I。在HPV16 E2上常見的核苷酸突變位點(diǎn)為C2295A、C2546T，所對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)門135 K、P219S。同時(shí)，E1上存在較多的同義突變，可說明E1蛋白的保守性較好。

在本研究發(fā)現(xiàn)的HPV16 E1的核苷酸突變位點(diǎn)T98C(2/34，5.88%)、G252A(1/34,2.94%)、C568T(1/34,2.94%)、T600C(1/34,2.94%)、A844T(1/34,2.94%)、A945G(1/34,2.94%)均未見報(bào)導(dǎo)。HPV16 E2位于反式激活域的核苷酸突變位點(diǎn)G2204A(4/53,7.55%)和位于DNA結(jié)合域的核苷酸突變位點(diǎn)T2956C(1/53,1.89%)也未見報(bào)導(dǎo)。在病例組和對(duì)照組的HPV16 E1基因序列的分子變異分析中，有兩個(gè)位點(diǎn)的變異表明病例組與對(duì)照組之間具有顯著性差異(P<0.05)。分別為T98C和G651A，由于E1蛋白是參與HPV復(fù)制的蛋白，在減輕宿主防御和破壞正常細(xì)胞循環(huán)過程方面發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)展，在病例組與對(duì)照組中存在差異，則可進(jìn)一步說明這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可能促進(jìn)影響HPV16復(fù)制的E1蛋白質(zhì)表達(dá)，從而降低宿主細(xì)胞的防御能力，最終可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。而在HPV16 E2基因序列的分子變異分析中，未發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組和病例組間具有差異的位點(diǎn)。未來可擴(kuò)大標(biāo)本量，結(jié)合臨床信息分析核苷酸位點(diǎn)突變對(duì)癌癥的影響。由于HPV E1蛋白與E2反式激活域結(jié)合，定位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，共同調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄作用，E1上T98C和G651A的突變也可能會(huì)影響其與E2蛋白的結(jié)合作用。同時(shí)由于部分堿基的突變會(huì)導(dǎo)致氨基酸的變異，氨基酸改變可能對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生影響，未來也可以在結(jié)合細(xì)胞學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)上來研究HPV16 E1、E2變異體在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。