基于促黑色素合成分子的結(jié)構(gòu)相似性篩選潛在白癜風(fēng)的治療藥物

丁瓊，于蘭，羅林，黃思露，王曉琴，張波

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的慢性獲得性皮膚疾病，其全球發(fā)病率為0.5%～1%[1]。除了會(huì)給白癜風(fēng)患者帶來(lái)心理障礙外，還可能誘發(fā)甲狀腺疾病[2]、缺鐵性貧血[3]、銀屑病[4]、感音神經(jīng)性耳聾[5]等。盡管目前對(duì)白癜風(fēng)發(fā)病原因的研究工作取得了一些飛躍性的進(jìn)展，但是該病的確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明。

促進(jìn)色素的合成對(duì)白癜風(fēng)的治療至關(guān)重要。黑色素的合成直接受酪氨酸酶，酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶1(TRP-1)和多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)的調(diào)控。酪氨酸酶催化L-酪氨酸羥基化為3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，是黑色素合成的關(guān)鍵限速酶。這些黑色素合成相關(guān)酶的表達(dá)受小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的調(diào)節(jié)，在上游信號(hào)通路中，MITF可以響應(yīng)α-MSH/ cAMP、Wnt和MAPK三個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在下游信號(hào)通路中，MITF能夠指導(dǎo)TYR家族成員(TYR、TPR-1、DCT)在黑素細(xì)胞中的特異性表達(dá)，從而產(chǎn)生黑色素[6]。

目前，對(duì)白癜風(fēng)的治療主要包括NB-UVB等物理治療，自體表皮移植等外科手術(shù)治療，糖皮質(zhì)激素，免疫調(diào)節(jié)劑，維生素D衍生物和光敏劑如8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)等藥物治療。由于藥物治療的無(wú)創(chuàng)性和良好的適應(yīng)性，無(wú)論是白癜風(fēng)穩(wěn)定期還是進(jìn)展期，均可為患者所接受。新藥研發(fā)中基于藥效基團(tuán)、分子對(duì)接、定量構(gòu)效關(guān)系從化合物庫(kù)中篩選先導(dǎo)化合物逐漸受到研究者們的關(guān)注。因此，本文通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘及文獻(xiàn)搜索方法找出治療白癜風(fēng)的潛在化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性原理、構(gòu)效關(guān)系、分子對(duì)接方法等發(fā)現(xiàn)可能的先導(dǎo)化合物并做驗(yàn)證以期對(duì)白癜風(fēng)的治療帶來(lái)啟示。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用試劑具體如下。

DMEM培養(yǎng)基由GIBCO公司提供；胎牛血清由杭州四季青有限公司提供；青鏈霉素混合液(100×)由北京索萊寶科技有限公司提供；Ermanin(純度≥98%),Tamarixetin(純度≥98%),8-MOP(純度≥98%)由上海源葉生物科技有限公司提供；Quercetin 3,4’-dimethyl ether(純度≥98%)由上海澄紹生物科技有限公司提供；MTT,DMSO，L-DOPA由美國(guó)Sigma公司提供；UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Ki由美國(guó)Thermo公司提供；SYBR Green PCR Kit由德國(guó)QIAGEN公司提供。

1.2 促黑色素生成的化合物的挖掘并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)

在PubMed中，以“vitiligo or melanin or melanogenesis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集報(bào)道有促進(jìn)色素生成的天然產(chǎn)物并用orange 3.23.1軟件進(jìn)行層次聚類。為了整體評(píng)價(jià)藥物對(duì)肝藥酶的影響，本文引入肝藥酶代謝整體評(píng)價(jià)模型[7]，見(jiàn)公式1，并利用其進(jìn)行篩選，通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)的基于子結(jié)構(gòu)鍵的2D Taimoto相似性評(píng)分來(lái)量化兩個(gè)化合物之間的結(jié)構(gòu)相似性并進(jìn)行結(jié)構(gòu)聚類[8]。

score=∑k(result)(Q)。

(1)

1.3 化合物與酪氨酸酶蛋白分子對(duì)接

分子對(duì)接參照文獻(xiàn)并作修改[9]。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)下載酪氨酸酶(PDB ID:4P6R)蛋白pdb結(jié)構(gòu)文件。運(yùn)用PyMOL(https://pymol.org/2/)軟件刪除酪氨酸酶蛋白復(fù)合物中多余的鏈及水分子，分離出配體和受體，運(yùn)用開(kāi)源軟件AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)其加氫，計(jì)算電荷，保存為pdbqt文件，作為對(duì)接受體。從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc.docking.org/)下載化合物結(jié)構(gòu)文件，小分子化合物結(jié)構(gòu)文件經(jīng)過(guò)加極性氫，計(jì)算電荷和添加原子類型，所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)等操作后，保存為pdbqt格式，作為對(duì)接配體。根據(jù)陽(yáng)性藥8-MOP在酪氨酸酶蛋白復(fù)合物中尋找到的最佳位點(diǎn)，將其坐標(biāo)確定為對(duì)接的活性位點(diǎn)，根據(jù)其活性口袋設(shè)置Gridbox坐標(biāo)及大小，采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行受體-配體分子對(duì)接，并對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析處理。

1.4 B16F10細(xì)胞培養(yǎng)及活力測(cè)定

將B16F10細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于含有5%CO2，37°C的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。B16F10細(xì)胞活力測(cè)定采用MTT法，將指數(shù)生長(zhǎng)的B16F10細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中過(guò)夜，用各濃度(0、4、8、16、32、64 μmol·L-1)的Ermanin(以下簡(jiǎn)稱Erm),Tamarixetin(以下簡(jiǎn)稱Tam),Quercetin 3,4’-dimethyl ether(以下簡(jiǎn)稱Que) 3個(gè)化合物處理48 h，加入20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液并孵育4 h。吸掉培養(yǎng)基后，將所得的甲瓚溶于150 μL二甲基亞砜，然后將板子置于振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(570 nm)。

1.5 B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測(cè)定

如前所述并稍作修改[10]，將B16F10細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度種在6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，使用臨床用于治療白癜風(fēng)的化合物8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP，20 μmol·L-1)作為陽(yáng)性對(duì)照，用各濃度(4、8、16 μmol·L-1)的Erm、Tam、Que及8-MOP 4個(gè)化合物處理48 h。用0.25%的胰酶消化收集于離心管中并計(jì)數(shù)，細(xì)胞沉淀加入1 mL含10%DMSO-NaOH溶液于80 ℃煮1 h,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液100 μL置于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔于405 nm測(cè)定吸光度。

1.6 酪氨酸酶活性測(cè)定

如前所述并稍作修改[11],以L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)氧化速率來(lái)評(píng)估酪氨酸酶活性。將B16F10細(xì)胞與Erm、Tam、Que 3個(gè)化合物及陽(yáng)性藥8-MOP處理48 h后，用冷PBS洗兩遍，用含有1%Triton X-100的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)裂解，并在80 ℃冷凍60 min，然后以15 000 r·min-1離心20 min。收集150 μL蛋白質(zhì)溶液置于離心管中，并使用Bradford標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法(BSA)對(duì)每種裂解物中的蛋白質(zhì)量進(jìn)行定量。每20 μL的裂解物中加入15 mmol·L-1L-DOPA于37 ℃孵育30 min,反應(yīng)產(chǎn)物多巴色素吸光度于475 nm測(cè)定。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用UNIQ-10柱式Trizol 總RNA提取試劑盒提取總RNA，并以A260/A280、A260/A230的比例評(píng)估RNA的質(zhì)量。使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列及長(zhǎng)度如表1。通過(guò)基于SYBR Green的Rotor-Gene Q(Qiagen，German)對(duì)樣品中的mRNA進(jìn)行分析，并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量。

表1 基因引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用SPSS 18.0和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組比較，或使用Student′s t-test進(jìn)行兩組間比較，結(jié)果報(bào)告為mean ± SD。結(jié)果的顯著性設(shè)置為P<0.05(*、#)，P<0.01(**)。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，#表示實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性藥組比較。

2 結(jié)果

2.1 潛在治療白癜風(fēng)的先導(dǎo)化合物

根據(jù)挖掘結(jié)果，經(jīng)過(guò)整合及去重后共找到47個(gè)化合物，將這些化合物進(jìn)行層次聚類，主要分為黃酮類，香豆素類，萜類等，其聚類信息如圖1所示。經(jīng)肝藥酶代謝整體評(píng)價(jià)模型篩選后最終共收集到21個(gè)可以促進(jìn)黑色素生成而有可能成為治療白癜風(fēng)的天然產(chǎn)物，其化合物信息具體如表2所示，結(jié)果顯示主要為黃酮類化合物。

表2 化合物化學(xué)信息

右側(cè)數(shù)字為PubChem CID號(hào)圖1 挖掘出的47個(gè)促黑色素生成化合物層次聚類圖

2.2 潛在治療白癜風(fēng)化合物的結(jié)構(gòu)聚類圖

維藥驅(qū)蟲斑鳩菊對(duì)白癜風(fēng)的治療有較好的療效，其中的主要化合物分子為黃酮類，且其黃酮類化合物分子山柰素已被證明有促進(jìn)色素生成[12]。此外，Thomas Walle教授證明了帶有甲氧基官能團(tuán)(-OCH3)的黃酮類化合物比沒(méi)有甲氧基官能團(tuán)的黃酮類化合物有更高的肝代謝穩(wěn)定性和腸道吸收[13]。Ippei Horibe等[14]學(xué)者指出甲氧基黃酮類化合物具有更好的促黑色素效果，且4′-OCH3比-OH更能刺激黑色素的生成，3-OCH3對(duì)黑色素生成有促進(jìn)作用。

因此，基于以上啟示，為尋找到更有效刺激黑色素生成的化合物，擬選出Ermanin(以下簡(jiǎn)稱Erm),Tamarixetin(以下簡(jiǎn)稱Tam)和Quercetin 3,4′-dimethyl ether(以下簡(jiǎn)稱Que)3個(gè)化合物并與該21個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)聚類。運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)的基于子結(jié)構(gòu)分子指紋的二維Tanimoto相似度評(píng)分量化的化合物之間的結(jié)構(gòu)相似性，結(jié)果如圖2所示。Erm、Tam和Que 3個(gè)化合物與這些符合Lipinski五原則的具有促進(jìn)色素生成功效的黃酮化合物的2D Tanimoto相似性指數(shù)大于0.8，且與陽(yáng)性藥8-MOP的相似度大于0.8。

圖2 3個(gè)化合物與潛在治療白癜風(fēng)化合物的結(jié)構(gòu)聚類圖

2.3 優(yōu)選出的化合物分子與酪氨酸酶蛋白均具有較強(qiáng)親和力

酪氨酸酶是黑色素合成中的關(guān)鍵限速酶，為了預(yù)測(cè)這些化合物對(duì)其活性的影響，我們做了分子對(duì)接。酪氨酸酶(PDB ID:4P6R)蛋白pdb晶體結(jié)構(gòu)中包含的酪氨酸分子位于其活性位點(diǎn)中，而酪氨酸分子是酪氨酸酶結(jié)合的底物，因此，我們將酪氨酸保留在酪氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)中，以陽(yáng)性藥8-MOP去尋找酪氨酸酶的催化的活性位點(diǎn)，并以8-MOP找到的最佳活性口袋為活性位點(diǎn)，并將其他3個(gè)化合物分子分別對(duì)接到酪氨酸酶蛋白活性口袋中。結(jié)果如圖3所示，8-MOP與酪氨酸酶蛋白結(jié)合自由能為-5.6 kcal·mol-1，結(jié)合的氨基酸殘基為ASN-152和THR-156。Erm、Tam和Que 3個(gè)化合物分子與酪氨酸酶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)均為ASN-152和GLY-212，與陽(yáng)性藥8-MOP都有共同結(jié)合殘基ASN-152，這3個(gè)化合物結(jié)合自由能分別為-6.6 kcal·mol-1、-6.4 kcal·mol-1和-6.5 kcal·mol-1，且均比陽(yáng)性藥8-MOP低，一般認(rèn)為結(jié)合自由能小于-4.0 kcal·mol-1則化合物與靶點(diǎn)蛋白具有較強(qiáng)親和力，提示這3個(gè)化合物比8-MOP在預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn)上與酪氨酸酶蛋白有更好的親和力。

圖3 化合物分子與酪氨酸酶蛋白分子對(duì)接圖

2.4 優(yōu)選出的化合物對(duì)B16F10細(xì)胞活力的影響

MTT的結(jié)果如圖4所示。

在低濃度4、8、16 μmol·L-1下，B16F10細(xì)胞活力均在80%以上，在高濃度64 μmol·L-1時(shí)，B16F10細(xì)胞活力均在50%以下，且檉柳黃素對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性最大。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇4、8、16 μmol·L-1濃度進(jìn)行。

n=3，結(jié)果報(bào)告為mean ± SD圖4 3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)及對(duì)B16F10細(xì)胞活力的影響

2.5 優(yōu)選出的化合物對(duì)B16F10細(xì)胞均有促進(jìn)黑色素生成的能力

3個(gè)化合物對(duì)B16F10細(xì)胞色素的影響如圖5所示。

給藥48 h后，相差顯微鏡拍攝B16F10細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Erm給藥組B16F10細(xì)胞明顯變黑，且呈劑量依賴性，說(shuō)明Erm能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素積累，且16 μmol·L-1組相較于陽(yáng)性藥8-MOP組更黑。16 μmol·L-1的Tam組B16F10細(xì)胞相較于對(duì)照組明顯變黑，說(shuō)明Tam也能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素積累。Que給藥組B16F10細(xì)胞也略有變黑而無(wú)明顯變化。

與對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01；與陽(yáng)性藥8-MOP組比，#P <0.05；n=3。圖5 B16F10細(xì)胞形態(tài)圖(A，200X)、相對(duì)色素含量圖(B)

B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測(cè)定結(jié)果顯示，3個(gè)化合物均能促進(jìn)B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素積累，且呈劑量依賴性。其中，Erm促進(jìn)黑色素積累的能力最強(qiáng)，且比陽(yáng)性藥8-MOP組促進(jìn)色素積累的能力強(qiáng)，8 μmol·L-1、16 μmol·L-1濃度的Erm相較于陽(yáng)性藥組具有顯著性。

2.6 優(yōu)選出化合物分子增強(qiáng)酪氨酸酶活性

根據(jù)L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)氧化速率來(lái)評(píng)估酪氨酸酶活性的結(jié)果如圖6顯示。

3個(gè)化合物均能增強(qiáng)酪氨酸酶的活性，且呈劑量依賴性。其中，Erm增強(qiáng)酪氨酸酶活性的能力最強(qiáng)，在16 μmol·L-1時(shí)相較于陽(yáng)性藥組具有顯著性。同時(shí)也說(shuō)明，分子對(duì)接預(yù)測(cè)的結(jié)果也具有一定的可信度。

與對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01；與陽(yáng)性藥8-MOP組比，#P<0.05；(n=3)。圖6 酪氨酸酶活性圖

2.7 RT-qPCR測(cè)定色素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)率

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果如圖7顯示，Erm能促進(jìn)TYR、DCT及MITF基因的表達(dá)，且呈劑量依賴性。各濃度下的Erm處理組的TYR基因的表達(dá)率較陽(yáng)性藥組高且具有顯著性。16 μmol·L-1的MITF基因表達(dá)率較陽(yáng)性藥組高且具有顯著性。Tam處理組能促進(jìn)TYR、TRP-1、DCT及MITF基因的表達(dá)且均呈劑量依賴性，16 μmol·L-1的Tam處理組的TYR基因表達(dá)率相較于陽(yáng)性藥組高且具有顯著性。16 μmol·L-1的Que處理組的TYR及DCT基因相較于對(duì)照組具有顯著性。

與對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01；與陽(yáng)性藥8-MOP組比，#P<0.05;n=3。圖7 RT-qPCR顯示與黑色素生成相關(guān)基因TYR、TRP-1、DCT及MITF基因的相對(duì)表達(dá)率

3 討論

白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究者們對(duì)其發(fā)病機(jī)制提出了各種假說(shuō)，主要涉及遺傳學(xué)說(shuō)，精神-神經(jīng)學(xué)說(shuō)，自身免疫學(xué)說(shuō)，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)，鋅-α2-糖蛋白(Zinc-α2-Glycoprotein)缺乏學(xué)說(shuō)，病毒學(xué)說(shuō)，黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說(shuō)等[15]。由于其機(jī)制的復(fù)雜性，尚無(wú)安全有效能治愈白癜風(fēng)的藥物。因而治療白癜風(fēng)的先導(dǎo)化合物的開(kāi)發(fā)及研究具有重大意義。

其中，潛在治療白癜風(fēng)的先導(dǎo)化合物的模擬預(yù)測(cè)對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要，可能會(huì)大大增加準(zhǔn)確性及減少投入成本，合理藥物設(shè)計(jì)即基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，它應(yīng)用受體結(jié)構(gòu)的有關(guān)知識(shí)，來(lái)指導(dǎo)和輔助藥物分子的設(shè)計(jì)[16]。而基于受體的結(jié)構(gòu)相似性原理也受到了研究者們的熱捧，即相似的藥物可能會(huì)有相似的功效，雖然有的藥物相似性很高卻功效稍有差別或者是完全相反，但是結(jié)構(gòu)性相似性原理在藥物預(yù)測(cè)中仍然存在極大的意義并引導(dǎo)著研究者們開(kāi)發(fā)新藥[17]。我們使用了來(lái)自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)的基于子結(jié)構(gòu)鍵的二維Tanimoto相似度評(píng)分來(lái)量化化合物之間的結(jié)構(gòu)相似性，其原理是PubChem將化合物生成二進(jìn)制指紋，以表示每種化合物是否存在特定的化學(xué)亞結(jié)構(gòu),其Tanimoto分?jǐn)?shù)始終在0到1之間，在95%的顯著性水平上，Tanimoto分?jǐn)?shù)為0.68或更高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用PubChem根據(jù)候選化合物的分子指紋特征，將他們進(jìn)行結(jié)構(gòu)聚類，每個(gè)聚類簇的化合物都具有相似的屬性，Ermanin,Tamarixetin,Quercetin 3,4′-dimethyl ether 3個(gè)化合物與藥性藥8-MOP的 2D Tanimoto相似性指數(shù)大于0.8，其相似性指數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分子對(duì)接是一種將配體放入其受體結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算方法。它的本質(zhì)是已知受體(一般為蛋白)大分子和配體小分子的結(jié)構(gòu)以及在受體大分子的對(duì)接位點(diǎn)和空間范圍，獲得配體小分子與大分子靶標(biāo)在結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的各種構(gòu)象，并對(duì)各個(gè)構(gòu)象進(jìn)行能量值打分，找到配體小分子和受體大分子結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象，得到最佳的對(duì)接[18]。3個(gè)化合物及陽(yáng)性藥與酪氨酸酶蛋白活性位點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果也顯示其結(jié)合能均小于-4 kcal·mol-1，其與酪氨酸酶蛋白的親和力較高。在后續(xù)的酪氨酸酶活性測(cè)定中也證明了這一點(diǎn)，3個(gè)化合物均能增強(qiáng)酪氨酸酶的活性。

通過(guò)黑色素含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)結(jié)構(gòu)相似的化合物均能增加黑色素的含量，且Erm化合物促進(jìn)黑色素生成的效果最好，Tam次之，Que相對(duì)較差，其結(jié)果的差異對(duì)我們探索構(gòu)效關(guān)系也有一定的啟示，三者在結(jié)構(gòu)上有3處不同點(diǎn)，即3位，3′位和4′位，結(jié)合前人的研究[19]，黃酮結(jié)構(gòu)4′-OCH3比-OH更能刺激黑色素的生成，3′位-OH存在時(shí)，3位-OCH3的存在對(duì)色素合成有消極影響。

本實(shí)驗(yàn)采用的模型為B16F10細(xì)胞，為黑色素瘤細(xì)胞，雖已被大量的研究者們用于促黑色素生成的藥物篩選[20]，對(duì)于藥物篩選具有廉價(jià)，方便，快捷的特點(diǎn)，雖有一定的可取性，但是后續(xù)模擬白癜風(fēng)并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，可能C57BL/6小鼠及其原代黑色素細(xì)胞，斑馬魚等更合適。

3個(gè)化合物分子均能上調(diào)TYR基因的表達(dá)，尤其是16 μmol·L-1Erm和16 μmol·L-1Tam，其TYR基因的上調(diào)倍率分別是4.2倍和3.3倍；與酪氨酸酶蛋白的分子對(duì)接顯示其與該蛋白的結(jié)合能分別為-6.6 kcal·mol-1,-6.4 kcal·mol-1，比陽(yáng)性藥8-MOP的結(jié)合能-5.6 kcal·mol-1低；此外，酪氨酸酶的活性也呈劑量依賴性增加，基于這些線索，Erm和Tam可能是直接增強(qiáng)酪氨酸酶的活性而促進(jìn)黑色素生成。

在后續(xù)白癜風(fēng)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中有幾個(gè)值得探索的方向。首先關(guān)于化合物的結(jié)構(gòu)相似性評(píng)分，我們?cè)诖耸褂昧嘶衔?D結(jié)構(gòu)信息，因?yàn)槠湓陬A(yù)測(cè)中產(chǎn)生較好的結(jié)果(Molecular similarity in medicinal chemistry)。后續(xù)若可以獲得更準(zhǔn)確的化合物3D結(jié)構(gòu)可靠的3D結(jié)構(gòu)相似性指標(biāo)時(shí)，我們可以基于3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性分析，其結(jié)果可能更具準(zhǔn)確性。其次，已初步驗(yàn)證了這3個(gè)化合物有促進(jìn)色素生成的作用，這3個(gè)化合物能否成為治療白癜風(fēng)的化合物需要后續(xù)更深入的研究。