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    絲膠對(duì)絲素/絲膠共混材料結(jié)構(gòu)和性能的影響

    2021-03-06 00:04:21孫笑笑程志玲李明忠
    關(guān)鍵詞:絲膠絲素紡絲

    孫笑笑,程志玲,王 穎,李明忠

    (蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215021)

    家蠶絲是由約75%的絲素蛋白、25%的絲膠蛋白以及1%~5%的蠟質(zhì)、脂肪、無(wú)機(jī)物及色素組成。絲膠蛋白包裹在兩根絲素單絲的外圍,具有黏合與保護(hù)作用[1]。絲素蛋白由20種氨基酸組成,其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸三種中性氨基酸的合計(jì)占80%以上。絲素蛋白主要組分的H-鏈的核心區(qū)域中,大部分氨基酸序列以“-甘氨酸-X-”(X中65%為丙氨酸、23%為絲氨酸、9%為酪氨酸)的規(guī)律重復(fù)出現(xiàn),鏈段間平行排列,并依靠氫鍵緊密結(jié)合,形成反平行β-折疊構(gòu)象,進(jìn)而形成silk II結(jié)晶結(jié)構(gòu)。具備這種結(jié)構(gòu)的絲素材料強(qiáng)度高,生物降解速度慢,且具有較強(qiáng)的熱力學(xué)穩(wěn)定性[2]。絲素蛋白中的silk I結(jié)晶結(jié)構(gòu)是由α-型分子構(gòu)象的絲素蛋白鏈段堆積而成的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)[3]。經(jīng)濕熱、應(yīng)力作用、極性溶劑等處理后,silk I可以向silk II轉(zhuǎn)變[4]。與絲素蛋白不同,組成絲膠蛋白的主要氨基酸是絲氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸及蘇氨酸等,這四種氨基酸的合計(jì)占70%以上[5]。大部分氨基酸側(cè)鏈帶有羧基、羥基等極性基團(tuán),因此絲膠表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性及化學(xué)反應(yīng)活性[6]。絲膠是復(fù)合蛋白,分子量分布于24~400 kDa,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[7],難以形成結(jié)晶結(jié)構(gòu),故以純絲膠制成的材料結(jié)構(gòu)欠穩(wěn)定,強(qiáng)度較低且易被生物降解[8]。

    用絲膠與絲素共混是調(diào)節(jié)絲蛋白材料的凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化性能及生物學(xué)性能的途徑之一。將天然蠶絲中的絲膠和絲素蛋白分別溶解和純化后,采用澆鑄、冷凍干燥、濕法紡絲、高壓靜電紡絲、脫水等材料成形技術(shù),可制備出絲素/絲膠共混薄膜、三維多孔材料、纖維、凝膠、顆粒等多種形態(tài)的絲蛋白材料,用于創(chuàng)面修復(fù)、組織引導(dǎo)、手術(shù)縫合、藥物控制釋放等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[9-11]。絲膠所占比例對(duì)絲蛋白材料的凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)、微觀形貌、力學(xué)性能、水溶性以及生物降解速度、細(xì)胞相容性等生物學(xué)性能均有不同程度的影響。

    1 絲膠對(duì)絲素/絲膠共混膜結(jié)構(gòu)和性能的影響

    絲素/絲膠共混膜中絲膠所占比例對(duì)膜的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯影響。將蠶繭置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的碳酸鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的馬賽皂的混合溶液中沸煮1 h脫膠后,在LiBr溶液中溶解并經(jīng)透析后獲得絲素蛋白溶液。繭殼在120℃水中處理1 h,過(guò)濾獲得絲膠蛋白溶液。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的絲素和絲膠溶液以75∶25的比例混合,流延法80℃干燥成膜,最后用甲醇處理制得絲素/絲膠共混膜,經(jīng)相同程序制得的純絲素膜作為對(duì)照組。差示掃描量熱法測(cè)試結(jié)果顯示,純絲素膜經(jīng)甲醇處理后,原220℃處的熱吸收峰和177℃處的玻璃化轉(zhuǎn)變消失,表明絲素結(jié)構(gòu)由silk I向silk II轉(zhuǎn)變,而絲素/絲膠共混膜在這兩處的吸熱-放熱變化仍能觀察到。X-射線衍射測(cè)試結(jié)果表明,甲醇處理前的絲素膜為無(wú)定形結(jié)構(gòu),甲醇處理后的絲素膜在衍射角20°附近出現(xiàn)強(qiáng)衍射,表明結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成;而經(jīng)甲醇處理前后絲素/絲膠共混膜的X-射線衍射曲線沒(méi)有顯著差異。紅外吸收光譜顯示純絲素膜在經(jīng)甲醇處理78 s后β-折疊結(jié)構(gòu)占優(yōu)勢(shì),而絲素/絲膠共混膜在180 s后才有β-折疊結(jié)構(gòu)形成。以上結(jié)果說(shuō)明絲素/絲膠共混膜中的絲膠組分能延緩絲素β-折疊結(jié)構(gòu)形成,抑制絲素形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)[2]。

    絲素/絲膠共混膜中絲膠所占比例對(duì)膜的水溶性及機(jī)械性能有明顯影響。將繭殼在水中沸煮40 min獲得絲膠溶液,在絲膠溶液中添加絲素,用聚乙二醇縮水甘油醚作交聯(lián)劑制得絲素/絲膠質(zhì)量比為0/100、10/90、20/80、30/70和40/60的共混膜。隨著共混膜中絲膠所占比例的降低,膜的彈性模量有所下降,絲膠比例在90%左右時(shí)共混膜斷裂強(qiáng)度和彈性較高,彈性形變可達(dá)91.6%[12]。

    絲素/絲膠共混膜中絲膠所占比例對(duì)成纖維細(xì)胞在膜表面黏附、增殖的影響,與絲素、絲膠的來(lái)源有關(guān)。從成熟的家蠶幼蟲的后部絹絲腺提取絲素、絲膠蛋白,流延法干燥制膜,并用甲醇處理。研究小鼠成纖細(xì)胞L929在再生絲蛋白膜上的黏附和增殖[13]。結(jié)果表明,當(dāng)共混膜中絲膠所占比例為55%或93%時(shí),細(xì)胞在膜表面的黏附率及細(xì)胞活力低于純絲素膜或純絲膠膜。通過(guò)用不同濃度的油酸鈉和碳酸鈉對(duì)繭殼脫膠,獲得殘膠率在0%~16%范圍的蠶絲,脫膠程度不同的蠶絲用CaCl2/H2O/EtOH三元溶劑溶解,純化、干燥后制得含膠率不同的蠶絲蛋白固體,再將蠶絲蛋白固體溶解于980 mg/mL的甲酸溶液中,流延法25℃干燥制膜。成纖維細(xì)胞NIH 3T3在膜表面進(jìn)行體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞增殖活力隨著膜內(nèi)絲膠占比的增多而下降[14]。

    以上研究表明,絲膠所占比例對(duì)絲素/絲膠共混膜的凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)、水溶性、機(jī)械性能和生物相容性都有不同程度的影響。絲膠能延緩絲素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成,進(jìn)而影響共混膜的強(qiáng)度、親水性、水溶性等物理性能。絲膠所占比例對(duì)絲素/絲膠共混膜細(xì)胞相容性的影響與絲素、絲膠的來(lái)源有關(guān)。

    2 絲膠對(duì)絲素/絲膠共混多孔材料結(jié)構(gòu)和性能的影響

    用蒸餾水于130℃處理蠶絲30 min得到絲膠蛋白;用0.02 mol/L的Na2CO3溶液將蠶絲脫膠后,用LiBr溶液溶解、透析后獲得絲素蛋白。絲膠、絲素蛋白溶液按照質(zhì)量比0/100,2/98,4/96,6/94,8/92混合后,加入致孔顆粒NaCl,室溫存放2 d后用水浸泡去除NaCl,得到共混比例不同的絲膠/絲素多孔材料[15]。電子顯微鏡觀察到絲膠/絲素共混比為6/94和8/92時(shí),多孔材料內(nèi)孔壁上有大量凸起,這是絲膠與絲素產(chǎn)生相分離的表現(xiàn)??讖郊翱紫堵实脑囼?yàn)結(jié)果表明,隨著絲膠所占比例的增大,多孔材料內(nèi)部的孔徑及孔隙率有所增大,材料的壓縮回彈性提高。絲膠/絲素共混比為6/94和8/92時(shí)多孔材料的壓縮回彈率可達(dá)100%。

    脫膠不充分的蠶絲用作手術(shù)縫合線有引起炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[16-17],研究免疫細(xì)胞對(duì)絲素/絲膠多孔支架的應(yīng)答及炎癥因子的釋放是評(píng)估其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的手段之一。將繭殼置于Na2CO3溶液中于90℃處理1 h,溶液經(jīng)透析、乙醇誘導(dǎo)沉淀、干燥后獲得絲膠固體。脫膠繭殼用LiBr溶解,純化后獲得絲素溶液。將絲膠固體溶解于絲素溶液中,經(jīng)冷凍干燥、戊二醛蒸汽交聯(lián)后分別得到絲素/絲膠共混比為100/0、75/25、50/50、25/75、0/100的多孔支架。在各支架上接種和培養(yǎng)成骨細(xì)胞MG-63進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)的結(jié)果顯示,培養(yǎng)1 d和7 d后各實(shí)驗(yàn)組之間乳酸脫氫酶釋放量無(wú)明顯差異,顯示絲素/絲膠支架中絲膠占比對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。在不同絲素/絲膠共混比的支架上接種和培養(yǎng)人單核-巨噬細(xì)胞THP-1,并使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)分析炎癥因子的表達(dá),結(jié)果顯示培養(yǎng)1 d后各支架組趨化因子CXCL10的表達(dá)水平都很低;隨著支架中絲膠占比的增大,白細(xì)胞相關(guān)抗原CD197和腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)水平有所增高,腫瘤壞死因子TNF-α的分泌量有所增多,但TNF-α的分泌量遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照組,表明絲膠雖有一定的致炎風(fēng)險(xiǎn),但不顯著[18]。

    現(xiàn)有研究表明,隨著絲素/絲膠多孔材料中絲膠所占比例的增大,材料內(nèi)部的孔徑、孔隙率、孔壁的粗糙程度增大,壓縮彈性增大,部分炎癥因子的表達(dá)有所增多,但對(duì)細(xì)胞毒性無(wú)顯著影響。

    3 絲膠對(duì)絲素/絲膠共混纖維結(jié)構(gòu)和性能的影響

    采用濕法紡絲及高壓靜電紡絲技術(shù)可制備微米或納米級(jí)的絲素/絲膠共混纖維網(wǎng),應(yīng)用于皮膚缺損創(chuàng)面時(shí),通常具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功能[19-20]。

    有研究表明,在用甲酸作為絲素和絲膠的共溶劑進(jìn)行濕法紡絲的過(guò)程中,當(dāng)絲素/絲膠共混材料中絲膠所占比例較低(絲膠占9.6%)時(shí),絲膠可通過(guò)與絲素的物理相互作用幫助絲素蛋白折疊,促進(jìn)絲素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成,并改善再生絲纖維的力學(xué)性能[21]。將絲素、絲膠固體以100/0、90/10和80/20三種質(zhì)量比溶解在LiBr溶液中,再經(jīng)純化、干燥獲得絲素/絲膠共混海綿。將共混海綿溶解在98%甲酸中來(lái)制備紡絲液,用濕法紡絲技術(shù)制備絲素/絲膠共混纖維,并進(jìn)行1~4倍牽伸。在相同牽伸倍率的條件下,絲膠占比較大者,制得的再生絲纖維的直徑較大;經(jīng)2倍以上牽伸后,含絲膠的再生絲纖維中絲素蛋白大分子的取向度更高,纖維的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率明顯高于不含絲膠的纖維[22]。

    用靜電紡絲技術(shù)可以制備絲素/絲膠共混納米纖維。將絲素、絲膠水溶液按照絲素/絲膠質(zhì)量比100/0、90/10、85/15和75/25混合后進(jìn)行高壓靜電紡絲,對(duì)得到的共混絲纖維進(jìn)行顯微拉曼光譜分析、熱分析和拉伸性能的測(cè)定結(jié)果表明,隨著絲膠所占比例的增大,α-型結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的特征吸收減弱,β-折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收增強(qiáng),熱分解溫度增高,拉伸強(qiáng)度提高,斷裂伸長(zhǎng)率降低[23]。

    4 絲膠對(duì)絲素/絲膠共混凝膠結(jié)構(gòu)和性能的影響

    絲素和絲膠都可自發(fā)完成溶膠向凝膠的轉(zhuǎn)變。在凝膠化過(guò)程中,絲蛋白大分子之間主要依靠氫鍵和靜電相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。水溶液中絲素或絲膠的濃度越高,則凝膠化速度越快[24-25]。絲膠蛋白的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變可逆,而絲素蛋白的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變不可逆。

    用Na2CO3和馬賽皂的混合溶液將繭殼脫膠后獲得絲素纖維;用含2-巰基乙醇的尿素溶液于80℃處理10 min,純化、干燥后獲得絲膠固體。將絲素纖維和絲膠固體分別溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中,經(jīng)透析后得到的絲素、絲膠溶液按照絲素/絲膠質(zhì)量比100/0、75/25、50/50、0/100混合,溶液中絲蛋白的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。在溶液于50℃保溫形成凝膠過(guò)程中,隨著溶液中絲膠所占比例的增大,凝膠化時(shí)間明顯延長(zhǎng),且觀察到的相分離現(xiàn)象更明顯。絲素溶液的凝膠化過(guò)程伴隨著無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變,而絲素/絲膠共混溶液中絲膠的存在延緩了向β-折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。紅外吸收光譜和X-射線衍射分析表明,共混凝膠中絲膠占比越高,則形成的凝膠內(nèi)部無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有所增多,而β-折疊結(jié)構(gòu)的含量下降,凝膠的水溶性提高,抗壓強(qiáng)度和壓縮模量有所減小[26]。這說(shuō)明在濃度較高的絲素/絲膠共混體系中,絲膠具有穩(wěn)定絲素的α-型結(jié)構(gòu)、阻止其向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,進(jìn)而延緩凝膠化的效應(yīng)。

    5 總結(jié)與展望

    絲素是纖維狀蛋白,而絲膠是球狀蛋白,二者的結(jié)構(gòu)、性能存在顯著差異。用絲膠與絲素共混是調(diào)節(jié)絲素材料結(jié)構(gòu)和性能的途徑之一。絲素/絲膠共混材料中絲膠所占比例,對(duì)材料內(nèi)絲蛋白的凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化性能、生物學(xué)性能都產(chǎn)生影響,影響程度與絲素和絲膠的來(lái)源、純化程度和方法、溶劑種類、溶液濃度等因素有關(guān)。絲素、絲膠的來(lái)源和純化方法不同,往往產(chǎn)生完全不同的結(jié)果,因此有待進(jìn)一步建立和完善絲素、絲膠的純化和鑒定技術(shù),在此基礎(chǔ)上深入探討二者在蛋白水平和納米尺度的相互作用規(guī)律,加強(qiáng)對(duì)絲膠的生物降解及免疫效應(yīng)的研究,加快將絲素、絲膠蛋白安全、有效地用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)程。

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