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    不同質(zhì)量卵裂期胚胎發(fā)育至囊胚能力的研究

    2021-03-06 01:46:08梁云浩馬才啟尹敏娜
    廣州醫(yī)藥 2021年1期
    關(guān)鍵詞:卵裂囊胚數(shù)目

    王 慧 劉 帥 梁云浩 馬才啟 陳 娟 尹敏娜

    廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 (廣州 510623)

    近年來,囊胚移植(blastocyst transfer,BT)因其能通過延長胚胎培養(yǎng)時間進一步篩選出發(fā)育潛能更高的胚胎,而越來越多的被臨床應(yīng)用。研究已證實囊胚移植同卵裂期胚胎移植相比,可以提高臨床妊娠率及胚胎著床率,減低多胎率[1- 4]。因此目前,很多中心都采取將受精后第 3 天(D3)的胚胎繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)至第 5 天(D5)和第6 天(D6)的臨床策略。但究竟什么質(zhì)量的卵裂期胚胎有更好的囊胚發(fā)育潛能,還沒有定論。目前,我們評價D3卵裂期胚胎質(zhì)量的好壞主要依賴胚胎形態(tài)學(xué)評分,通過胚胎的生長速率、碎片多少及卵裂球均一性來評價。本研究的目的在于通過研究D3不同質(zhì)量的卵裂期胚胎發(fā)育為囊胚的潛能,旨在為囊胚培養(yǎng)的結(jié)果預(yù)測提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    本研究回顧性分析2015年4月—2019年4月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心進行體外受精一胚胎移植(IVF—ET)治療的患者,胚胎納入標(biāo)準(zhǔn)為新鮮周期除去移植、冷凍剩余行囊胚培養(yǎng)的胚胎。經(jīng)患者知情同意后將剩余胚胎(共5 510枚)轉(zhuǎn)囊胚培養(yǎng),繼續(xù)觀察并記錄囊胚形成情況,有囊胚形成時根據(jù)形成囊胚的質(zhì)量選擇移植、冷凍或拋棄。

    1.2 促排卵治療方案及授精

    所有患者使用本中心常規(guī)促排卵方案。陰道B超監(jiān)測到3個或以上直徑≥18 mm卵泡時,肌肉注射5 000 U~10 000 U HCG(雪蘭諾,瑞士),36 h后在陰道B超監(jiān)測下采卵。

    取卵日根據(jù)男方精子質(zhì)量決定IVF或ICSI受精方式。授精18~20 h觀察原核,受精胚胎放在胚胎培養(yǎng)液(G1,vitrolife,Sweden)液滴中,置于6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

    1.3 D3卵裂期胚胎質(zhì)量評估及分組

    授精后D3根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評估胚胎質(zhì)量,記錄卵裂球數(shù)量,胚胎碎片率及卵裂球不對稱性等。評價標(biāo)準(zhǔn):優(yōu)質(zhì)胚胎定義為受精后第3天胚胎卵裂球數(shù)目為7或8個,卵裂球大小均勻,及碎片<15%;其余為非優(yōu)質(zhì)胚胎。挑選胚胎移植或冷凍,剩余胚胎均經(jīng)患者知情同意后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(G2,vitrolife,Sweden)液滴中,置于6%CO2培養(yǎng)箱進行囊胚培養(yǎng)。

    根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎質(zhì)量分為優(yōu)質(zhì)組(n=564)和非優(yōu)質(zhì)組(n=4 946);根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎卵裂球數(shù)量分為<4細胞組(n=661),4- 6細胞組(n=2 348),7- 9細胞組(n=2 090),>9細胞組(n=286)和融合期胚胎(Compact,CP)組(n=125);根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎卵裂球均一性多分為卵裂球大小均勻組(-)(n=1 966),卵裂球大小差異為(+)組(n=2 174)及卵裂球大小差異為(++/+++)組(n=1 370);根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎碎片多少分為碎片≤10%組(n=2 939),10%~25%組(n=1 574)及碎片>25%組(n=997)。

    1.4 囊胚培養(yǎng)及觀察

    授精后D5及D6觀察囊胚形成情況。囊胚評分采用Gardner評分方法[3]:根據(jù)囊腔擴張程度分為6 個時期。Ⅰ期:早期囊腔不超過囊胚總體積的1/2;Ⅱ期:囊腔體積超過囊胚總體積的1/2;Ⅲ 期:囊腔全占據(jù)整個囊胚;Ⅳ 期:囊腔繼續(xù)擴張,透明帶變薄;Ⅴ期:部分囊胚從透明帶中孵出;Ⅵ 期:囊胚完全孵出。處于Ⅲ~Ⅵ 期的囊胚根據(jù)內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞質(zhì)量進行分級。內(nèi)細胞團分級:A 級細胞排列緊密且數(shù)量多,B 級細胞排列松散且數(shù)量較少,C 級細胞數(shù)量很少。滋養(yǎng)層細胞分級:A 級上皮細胞層結(jié)構(gòu)致密且有較多細胞,B 級上皮細胞層結(jié)構(gòu)松散且細胞不多,C 級上皮細胞層由稀疏細胞組成。

    采用 Gardner囊胚分級系統(tǒng)[5],將 D5評分≥ⅢBB、D6評分≥ⅣBB 定為優(yōu)質(zhì)囊胚,將 D5評分>ⅢCC、D6評分>ⅣCC 定為可利用囊胚。

    1.5 評價指標(biāo)

    囊胚形成率=形成的囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù);優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù);可利用囊胚形成率=可利用囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    數(shù)據(jù)分析使用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計數(shù)資料以率(%)表示。率的比較采用χ2檢驗。描述各分析指標(biāo)與囊胚培養(yǎng)結(jié)局的關(guān)系用二分類Logistic回歸分析。顯著性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 D3胚胎質(zhì)量評估的各指標(biāo)與囊胚形成的關(guān)系

    2.1.1 D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成的關(guān)系:與優(yōu)胚組相比,D3非優(yōu)質(zhì)胚胎組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    2.1.2 D3胚胎卵裂球數(shù)目與囊胚形成的關(guān)系:與7- 9細胞組相比,融合期胚胎(CP)組和> 9細胞組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05);與7- 9細胞組相比,4- 6細胞組和<4細胞組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

    2.1.3 D3胚胎卵裂球大小均一性與囊胚形成的關(guān)系 :與卵裂球大小均勻(-)組相比,卵裂球大小差異為+組及卵裂球大小差異為++/+++組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

    2.1.4 D3胚胎卵裂球碎片率與囊胚形成的關(guān)系:與碎片<10%組相比,碎片為10%~25%組及碎片>25%組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

    表1 D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

    表2 D3胚胎卵裂球數(shù)目與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

    表3 D3胚胎卵裂球大小均一性與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

    表4 D3胚胎卵裂球碎片率與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

    2.2 Logistic分析

    將上述因素分析中的差異因素,即D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目、卵裂球均一性及碎片率做Logistic分析,用Forward LR方法,結(jié)果提示D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目、卵裂球均一性及碎片率均與可利用囊胚形成顯著相關(guān)(P<0.05)。隨著D3胚胎質(zhì)量的提高,卵裂球數(shù)目的增加,卵裂球均一性的提高,碎片率的減少,可利用囊胚形成也隨之提高。其中,D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目及均一性同可利用囊胚形成成正相關(guān),碎片率同可利用囊胚形成成負相關(guān)。在這些因素中,D3胚胎質(zhì)量和卵裂球數(shù)目對可利用囊胚形成有較大影響(表5)。

    表5可利用囊胚形成多因素Logistic回歸分析

    3 討 論

    以往的常規(guī)體外受精-胚胎移植( IVF-ET) 治療中,一般選擇受精后D3的卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎移植。近年來,隨著序貫培養(yǎng)體系的不斷完善,囊胚培養(yǎng)變得相對成熟。有研究表明,囊胚培養(yǎng)不僅有利于提高移植周期的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[6- 7],同時還可明顯降低多胎妊娠的發(fā)生率[8- 9]。目前對于很多中心而言,胚胎常規(guī)體外培養(yǎng)至D3時,是否行囊胚培養(yǎng),仍然需要我們根據(jù)D3胚胎質(zhì)量和患者的具體情況作出選擇。但究竟什么質(zhì)量的卵裂期胚胎有更好的囊胚發(fā)育潛能,目前還沒有定論。本研究回顧性分析了近四年來本中心新鮮周期中除去D3移植、冷凍外剩余行囊胚培養(yǎng)的5 510枚胚胎,探討不同質(zhì)量卵裂期胚胎和囊胚形成的相關(guān)性,為囊胚形成的預(yù)測提供依據(jù)。

    對于卵裂期胚胎質(zhì)量的評估,目前應(yīng)用最廣泛的依然是胚胎形態(tài)學(xué)評分系統(tǒng)。根據(jù)ESHERE 發(fā)布的2011 版Istanbul共識,在受精后(68±1)h觀察胚胎,綜合比較其卵裂球大小、數(shù)目、胞質(zhì)碎片等參數(shù)來評價。我們中心根據(jù)這些指標(biāo)綜合評估將D3胚胎分為優(yōu)質(zhì)胚胎和非優(yōu)質(zhì)胚胎。近來,雖然有觀點認為單從D3胚胎的形態(tài)來預(yù)測胚胎發(fā)育潛能不夠精確[10],但我們的研究結(jié)果仍然表明通過形態(tài)學(xué)評分選出的優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成各項指標(biāo)都要遠高于非優(yōu)質(zhì)胚胎(P<0.05)。非優(yōu)質(zhì)胚胎組的可利用囊胚形成率只有21.39%,這提示我們可以將D3的非優(yōu)質(zhì)胚胎進行囊胚培養(yǎng),以淘汰掉一些發(fā)育潛能差的胚胎,在D5或D6再將可利用囊胚進行冷凍,這樣可以降低患者的冷凍費用,為患者保存一些更有價值的胚胎。

    我們的Logistic分析結(jié)果顯示D3胚胎形態(tài)學(xué)評分的指標(biāo),包括卵裂球數(shù)目、均一性、胞質(zhì)碎片等都同可利用囊胚形成顯著相關(guān)(P<0.05)。相對而言,卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。生長速率是評估胚胎潛在活力的有力指標(biāo)。人類胚胎正常的發(fā)育速度是:受精后第1天為2細胞期,第2天為4- 6細胞期,第3天為7- 9細胞期。因此在 D3時,<7細胞胚胎發(fā)育較慢,>9細胞胚胎則發(fā)育較快。以往研究[11]表明,D3胚胎為7- 9細胞時,囊胚形成率最高,這說明卵裂速度過慢或過快都會對囊胚形成產(chǎn)生影響。但也有文獻報道[12]D3卵裂期胚胎卵裂球數(shù)>9個的更容易形成囊胚。我們的研究結(jié)果表明D3發(fā)育較快的胚胎(CP組和>9細胞組)和發(fā)育速度正常的胚胎(7- 9細胞)相比,囊胚形成的各項指標(biāo)并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。有學(xué)者[13]通過研究凍融周期中胚胎質(zhì)量與囊胚形成之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)7- 9細胞與>9細胞胚胎之間囊胚形成率相當(dāng),這與我們的研究結(jié)果一致。之前普遍認為D3為8細胞階段的胚胎是理想的移植胚胎。但也有一些研究顯示[14]發(fā)育較快的胚胎與8細胞胚胎有同等的臨床結(jié)局,最近也有學(xué)者通過Time-lapse 挑選發(fā)育速度較快的胚胎移植,也獲得較好的妊娠結(jié)局[15]。

    胚胎發(fā)育過慢,往往預(yù)示著發(fā)育潛能較低,生長較慢的胚胎異常的發(fā)生率比正常發(fā)育速度的胚胎明顯更高,胚胎質(zhì)量較差導(dǎo)致移植后的臨床妊娠率較低[16]。我們的結(jié)果也顯示4- 6細胞組和<4細胞組的囊胚形成各項指標(biāo)都要遠低于> 6細胞的胚胎。對于D3發(fā)育速度較慢的胚胎,可利用囊胚形成率低,不過仍有部分具有發(fā)育至囊胚的潛能。因此在臨床工作中,我們需在患者的囊胚培養(yǎng)費用和避免胚胎浪費等方面做出平衡,根據(jù)患者的不同情況綜合考量這部分胚胎是否要行囊胚培養(yǎng)。

    除了卵裂球數(shù)目是影響囊胚形成的一個重要因素外,胚胎碎片也與囊胚形成有關(guān)。碎片的形成可導(dǎo)致染色體異常,影響囊胚的形成。研究表明,移除碎片可以明顯降低Ⅳ期胚胎的凋亡指數(shù),有助于優(yōu)質(zhì)囊胚的形成[17]。 本研究的結(jié)果也顯示碎片率較高的胚胎繼續(xù)發(fā)育為囊胚及可利用囊胚的能力較差。

    我們的結(jié)果顯示D3卵裂球不對稱的胚胎囊胚發(fā)育潛能要低于卵裂球?qū)ΨQ的胚胎(P<0.05)。胚胎不對稱性的發(fā)生可能影響卵裂球細胞骨架的變化趨勢和極化,從而影響囊胚的形成。我們的Logistic分析結(jié)果顯示卵裂球均一性同可利用囊胚形成均顯著相關(guān)(P<0.05)。

    綜上所述,D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成密切相關(guān)。D3胚胎形態(tài)學(xué)評價的各項指標(biāo),包括卵裂球數(shù)目、均一性及胚胎碎片等均會影響到囊胚的形成及質(zhì)量。我們可以通過D3胚胎質(zhì)量預(yù)測其囊胚發(fā)育潛能,為患者提供最佳的個體化治療方案。

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