探討肺動脈高壓大鼠心肌損傷與氧化應(yīng)激損傷的相關(guān)性研究

翟子敬 秦文娟 王 臻 郭雪婷 王 忠 蘆桂林

1 石河子大學(xué)，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院(石河子 832008)2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科(石河子 832008)3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(石河子 832008)

肺動脈高壓(PAH)是由于肺血管的進(jìn)行性改變而導(dǎo)致肺動脈壓力的增加[1]。PAH時(shí)，右心室室壁代償性增厚，加重時(shí)，右心室擴(kuò)張，最終導(dǎo)致右心功能衰竭[2]。而PAH右心室心肌氧供—需失匹配是右心室重構(gòu)及右心衰發(fā)展過程中的重要病理生理基礎(chǔ)[3]，所以氧化應(yīng)激機(jī)制在疾病進(jìn)展過程中有著重要的作用。同時(shí)超聲心動圖作為簡便有效的檢查手段可實(shí)現(xiàn)對心臟結(jié)構(gòu)和功能的動態(tài)監(jiān)測[4]。本文旨在探討應(yīng)用超聲心動圖評價(jià)PAH造成的右心損害的臨床價(jià)值以及PHA造成右心損害的氧化應(yīng)激機(jī)制，對臨床診斷的進(jìn)一步研究提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

隨機(jī)選擇：48只雄性12周齡、且處于清潔級的SD大鼠，均來自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，[動物合格證號：SCXK(京)2012- 0001]，并經(jīng)石河子大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，同時(shí)提供：動物生存房間內(nèi)：溫度適宜20～25 ℃，濕度良好為50%～55%。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)詞料，自由進(jìn)食水，環(huán)境安靜。

1.2 主要使用試劑和儀器

野百合堿(Monocrota-line,MCT，美國，Sigma公司)；GEVivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，超低溫 4 ℃ 離心機(jī)(美國，Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本，Olympus公司)，以及全自動Bio-rad酶標(biāo)儀(美國，Biorad公司)；購買超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)試劑盒以及還原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒，各試劑盒均來自于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 動物分組隨機(jī)取48只SD雄鼠，(220±20)g，分為PAH 2周組(1%的MCT溶液腹腔一次性注射60 mg/kg)、PAH 4周組(1%的MCT溶液腹腔一次性注射60 mg/kg)、NaCl對照組(腹腔注射生理鹽水)及空白對照組(不做處理)，普通喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，每組12只，每日觀察，其中PAH組包括PAH 2周組及PAH 4組，對照組包括空白對照組及NaCl對照組。

1.3.2 超聲檢測采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，頻率為：12 MHz，探頭為：12S，其掃描速度為：100 mm/s。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射，麻醉大鼠，之后，于仰臥位的左胸緣，在大鼠心尖四腔心切面測量右心室室壁厚度(RVWT)、右心室舒張末期橫徑(RVEDD)，并于大動脈短軸切面測得肺動脈瓣血流前向加速時(shí)間(PAAT)。大鼠心率較快，大約為300～400次/min，所以每組均需連續(xù)取10個(gè)心動周期而求取平均值。

1.3.3 記錄左、右心室質(zhì)量指數(shù)及右心室肥大指數(shù)大鼠處死后，取心肺組織，剝離除左、右心室外其它組織，之后分離右心室游離壁(right ventricular，RV)與室間隔+左心室(interventricular septum+left ventricular，IVS+LV)，采用生理鹽水沖洗，并用濾紙吸水，之后稱重，計(jì)算右心室質(zhì)量指數(shù)RVMI=RV/體質(zhì)量(BW)，右心室肥大指數(shù)RVHI=RV/(IVS+LV)。

1.3.4 大鼠肺臟病理的觀察取左葉肺臟，進(jìn)行常規(guī)HE染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟改變。

1.3.5 取右心室心肌組織進(jìn)行HE染色，經(jīng)水洗、乙醇梯度脫水與二甲苯透明后，再通過浸蠟與包埋等制片過程之后由蘇木精染色、分化、返藍(lán)、梯度脫水和封片，最后分析由每只大鼠取得的右心室心肌各10張切片，觀察右心室心肌。

1.3.6 右心室膠原纖維的Masson染色取出原固定于4%多聚甲醛溶液中的右心室組織，脫水之后，經(jīng)過二甲苯透明，以及石蠟包埋等步驟后，再進(jìn)行冠狀位厚度為5 μm的切片固定，之后進(jìn)行石蠟切片，隨后脫蠟，并按順序用自來水和蒸餾水水洗，之后采用Regaud蘇木精染液，進(jìn)行染核5～10 min，之后充分使用水洗，再將切片放在麗春紅酸性復(fù)紅液中，染色8 min后，浸洗在冰醋酸水溶液中，再之后放入磷鎢酸，直接用苯胺藍(lán)5 min，最后，經(jīng)過脫水透明后封片。最終使用倒置顯微鏡觀察各組心肌間質(zhì)膠原纖維分布的情況。

1.3.7 心肌組織細(xì)胞中SOD活力和GSH、MDA水平取右室心肌組織剪碎，并由超聲機(jī)粉碎，進(jìn)而制備成10%的心肌組織勻漿液，然后經(jīng)過1 000 r/min離心10 min；之后取上清液，重復(fù)3次檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力，還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。

2 結(jié) 果

2.1 超聲心動圖檢測結(jié)果

與對照組比較，PAH右心室結(jié)構(gòu)及血流參數(shù)的變化：右心室壁顯著增厚及肺動脈瓣血流前向加速時(shí)間縮短，同時(shí)PAH 4周期組較PAH 2周組變化明顯。右心室橫徑在PAH 4周組變化明顯(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 超聲心動圖檢測大鼠右心室心功能參數(shù)

圖1 大鼠胸骨旁大動脈短軸；PA 表示肺動脈；AO表示主動脈；A: 對照組；B: PAH 4周組

圖2 大鼠肺動脈頻譜；A: 對照組；B: PAH 4周組

2.2 各組大鼠一般狀況及RVHI、RVMI的變化

對照組大鼠進(jìn)食與飲水正常，毛發(fā)正常有光澤，體質(zhì)量隨時(shí)間逐漸增加，而PAH組大鼠較對照組進(jìn)食飲水量減少，大鼠逐漸表現(xiàn)出體毛變暗淡、呼吸變急促、行動反應(yīng)較遲鈍等表現(xiàn)，體質(zhì)量顯著減輕且活動度顯著減低，同時(shí)PAH 4周期組較PAH 2周期組變化明顯。實(shí)驗(yàn)過程中均無大鼠死亡。經(jīng)野百合堿干預(yù)4周后，與對照組比較，PAH周組RVHI與RVMI明顯升高，造模成功，同時(shí)PAH 4周期組較PAH 2周期組變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 肺組織病理改變及大鼠肺中小型動脈比較

于光鏡下觀察HE染色后，肺組織中肺小型動脈結(jié)構(gòu)可顯示:在對照組大鼠肺小型動脈中，內(nèi)皮細(xì)胞薄厚程度表現(xiàn)一致，其分布較為均勻且連續(xù)，周邊未見明顯炎性細(xì)胞;然而PAH組大鼠的肺小型動脈表現(xiàn)為：形態(tài)不規(guī)整，內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性紊亂不整齊，部分內(nèi)緣呈嵴狀突向血管腔內(nèi)，血管壁明顯增厚，并且管腔面積明顯變小，同時(shí)伴隨血管周圍的炎癥改變，且PAH 4周組較為明顯。

表2 對照組及PAH組大鼠LVHI、RVHI、RVMI的比較

2.4 右心室病理改變

PAH組心肌細(xì)胞較對照組明顯肥大，心肌間隙明顯較之前增寬，且PAH 4周組較為明顯。

2.5 光鏡下觀察大鼠右心室心肌膠原纖維的變化

Masson染色顯示，對照組大鼠心肌肌間隙較窄，并清晰可見，且心肌細(xì)胞緊密排列，間隙內(nèi)可見到少量藍(lán)染的膠原纖維，分布稀疏，且著色淡。PAH組大鼠右心室心肌間隙明顯較之前增寬，且部分心肌間質(zhì)與膠原纖維呈現(xiàn)出紊亂的柵欄樣排列，纖維數(shù)量顯著增多，且PAH 4周組較為明顯。

2.6 大鼠右心室心肌組織細(xì)胞中SOD活力、GSH和MDA水平的變化

PAH組大鼠右心室心肌組織細(xì)胞中SOD活力、GSH和MDA水平的變化較對照組SOD活性和GSH水平降低，MDA水平上升，同時(shí)PAH 4周期組較PAH 2周期組變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3各組大鼠心臟組織細(xì)胞中SOD活力、GSH和MDA水平

2.7 超聲心動圖參數(shù)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究

RVWT與SOD呈極負(fù)相關(guān)(r=- 0.746,P<0.01)，與GSH呈極負(fù)相關(guān)(r=- 0.746,P<0.01)，與MDA呈極正相關(guān)(r=0.756,P<0.01)。RVEDD與SOD呈極負(fù)相關(guān)(r=- 0.848,P<0.01)，與GSH呈極負(fù)相關(guān)(r=- 0.855,P<0.01)，與MDA呈極正相關(guān)(r=0.825,P<0.01)。PAAT與SOD呈極正相關(guān)(r=0.980,P<0.01)，與GSH呈極正相關(guān)(r=0.979,P<0.01)，與MDA呈極負(fù)相關(guān)(r=- 0.980,P<0.01)。見表4。

表4超聲心動圖參數(shù)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究

3 討 論

肺動脈高壓(PAH)是由平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)蛋白的沉積等異常的結(jié)構(gòu)改變，并且隨著血管過度收縮，從而造成了肺血管的進(jìn)行性改變，同時(shí)肺血管阻力及肺動脈壓力的增加，繼而出現(xiàn)了右心室的一系列病變，最終導(dǎo)致右心室出現(xiàn)衰竭[5]。目前，MCT誘導(dǎo)PAH大鼠已廣泛應(yīng)用于對PAH造成右心室損傷的研究中。本研究表明了MCT可特異性損傷肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管及肺小動脈壁，以及出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞大量浸潤，從而造成了肺中小血管管壁增厚，并管腔狹窄，繼而出現(xiàn)較為明顯的血管重構(gòu)及小動脈內(nèi)血栓的形成，以及肺血管阻力增大，從而可造成右心室做功增加，研究結(jié)果與Liu等研究結(jié)果一致[6]，同時(shí)表明造模成功。

超聲心動圖以其簡便、快捷、可重復(fù)性的特點(diǎn)，在心臟損害的診斷過程中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)表明，PAH組小鼠的右心室結(jié)構(gòu)及血流變化較對照組變化明顯，且PAH 4周組RVWT與PAAT變化明顯于PAH 2周組，RVEDD僅在PAH 4周組變化明顯，這與PAH病理變化表現(xiàn)一致，當(dāng)發(fā)生PHA時(shí)，肺動脈血流速度明顯加快，肺動脈瓣前向血流加速時(shí)間縮短，右心室后負(fù)荷增大，右心室結(jié)構(gòu)的代償性肥厚、擴(kuò)張，將導(dǎo)致右心室搏出量的逐漸降低，甚至右心功能不全，因此超聲心動圖的對應(yīng)參數(shù)可較準(zhǔn)確評估PAH造成的心臟損害，對臨床評估PAH造成的心臟損害有著重要價(jià)值[7]。

右心室隨著PAH的進(jìn)行性病變而出現(xiàn)了右心室重構(gòu)現(xiàn)象，表現(xiàn)為右心室心肌細(xì)胞的體積變大，重量增加以及心肌間質(zhì)纖維化，且膠原纖維出現(xiàn)增多積聚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PAH組大鼠右心室隨著時(shí)間延長，心肌細(xì)胞肥大，心肌肌間隙增寬，膠原纖維顯著增多，并且呈柵欄樣紊亂排列。同時(shí)RVHI與RVMI明顯升高，都表明了PAH組大鼠心肌細(xì)胞在氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞浸潤等機(jī)制下隨著右心室后負(fù)荷增加而出現(xiàn)了逐漸代償性增大的現(xiàn)象，本研究結(jié)果與范志茹等研究結(jié)果相一致[5, 8]。

PAH形成后，隨著右心室病變持續(xù)進(jìn)展，右心室室壁會逐漸增厚，增厚的室壁會由于對氧的需求量明顯改變，耗氧量會逐漸增加，而供氧量卻逐漸減少，從而造成右心室的機(jī)械運(yùn)動效率減少[9-10]。同時(shí)會誘發(fā)機(jī)體中氧化應(yīng)激損傷活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生，因而會造成多種細(xì)胞大分子出現(xiàn)損傷，從而會改變細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，最終將引起細(xì)胞的凋亡，因?yàn)镽OS在體內(nèi)會受到SOD、GSH-PX以及CAT的催化后失活而被機(jī)體清除，因此這些酶在一定程度上可以保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷[11]。SOD活性下降會導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化損傷，繼而生成大量的MDA，與蛋白質(zhì)和核酸交聯(lián)，破壞其正常的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，最終將會影響其原有特征和功能，從而加重細(xì)胞損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PAH組大鼠右心室心肌細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性出現(xiàn)了明顯降低，MAD活性顯著升高，且隨著時(shí)間延長有升高的趨勢。此結(jié)果進(jìn)一步證明PAH會通過ROS的過量產(chǎn)生而對右心肌細(xì)胞造成一定損害，這與楊文莉等的研究一致，同時(shí)也表明了氧化應(yīng)激機(jī)制在PAH造成右心功能不全進(jìn)展中發(fā)揮著巨大的作用[13]。同時(shí)，通過對超聲心動圖的相關(guān)參數(shù)與氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)超聲心動圖與氧化應(yīng)激有著顯著的相關(guān)性。

目前對用超聲評價(jià)右心室結(jié)構(gòu)及功能尚處于早期，其臨床應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步證實(shí)，針對PAH患者右心室損傷機(jī)制的研究仍較少，缺乏指南指導(dǎo)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于小鼠心率較快，超聲心動圖的測量值也依賴于檢查醫(yī)生的水平，主觀差異性較大，同時(shí)標(biāo)本量較少，需要進(jìn)一步研究，為臨床提供更大的應(yīng)用價(jià)值。