循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診療中的研究進(jìn)展

曾 恒，胡尊琪 綜述 馮 丹 審校

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤致死率第四位[1]。由于其缺乏特異性早期癥狀和體征，腫瘤灶進(jìn)展迅速且較早發(fā)生局部浸潤和轉(zhuǎn)移，PC診療效果較差。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)定義為由腫瘤原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶自發(fā)脫落或因診療操作導(dǎo)致落入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[2]；CTCs在計(jì)數(shù)、表型變化上與腫瘤灶的狀態(tài)密切相關(guān)，眾多研究表明正是由于具有干細(xì)胞特性的CTCs從腫瘤灶脫落入血液系統(tǒng)而造成腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此外周血中存留的CTCs在惡性腫瘤的早期診斷、監(jiān)測療效、評(píng)估預(yù)后及指導(dǎo)治療上有重要價(jià)值。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測技術(shù)進(jìn)展

CTCs由腫瘤灶釋放入外周血后以單個(gè)或聚集成團(tuán)的形式存在，由于細(xì)胞微環(huán)境的改變，由于失巢凋亡、流體剪切力、免疫細(xì)胞殺傷等因素的影響，絕大部分細(xì)胞生存期很短，最終在外周血中存活的細(xì)胞極少，每毫升外周血僅含1～102個(gè)CTCs[3]，因此對(duì)檢測技術(shù)要求極高。

1.1 物理學(xué)特征富集法 密度梯度離心法主要基于血液中各種細(xì)胞的密度不同，利用分離介質(zhì)及高速離心分離腫瘤細(xì)胞，該方法不受細(xì)胞表面標(biāo)志物的影響，可獲得較高檢出率，但富集的CTCs純度較低且活性較弱。膜濾過法主要利用腫瘤細(xì)胞尺寸大于非腫瘤細(xì)胞的物理學(xué)特性分離，大多數(shù)研究認(rèn)為，濾過膜濾孔直徑在8 μm時(shí)可獲得最好濾過效果，該方法能較好地保持腫瘤細(xì)胞形態(tài)及活性，但并非所有腫瘤細(xì)胞直徑均大于8 μm且其他細(xì)胞直徑均小于8 μm，因此該方法的劣勢在于富集的CTCs純度不夠[4]。

1.2 免疫學(xué)特性富集法 (1)免疫磁珠法是利用特異性單克隆抗體標(biāo)記的磁珠結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原來識(shí)別CTCs，利用外加磁場吸附抗原-抗體復(fù)合物從而富集CTCs，最常選用的抗原為上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)[5]，這是因?yàn)榻^大部分腫瘤細(xì)胞上皮表達(dá)EpCAM而非腫瘤細(xì)胞基本不表達(dá)。目前唯一通過美國FDA批準(zhǔn)的Cellsearch系統(tǒng)即是利用偶連有EpCAM抗體的磁珠捕獲CTCs。但部分CTCs由于發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致細(xì)胞表面不再表達(dá)EpCAM等上皮型標(biāo)志物，因此該方法的缺點(diǎn)是CTCs的受檢率較低。(2)微流控芯片是利用外周血在芯片中流動(dòng)時(shí)通道表面抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)捕獲CTCs， 該種檢測方法整個(gè)富集流程高度自動(dòng)化，且富集的CTCs能保持較高活性[6]，但依然難以避免因EpCAM下調(diào)導(dǎo)致的受檢率較低的問題。

1.3 物理學(xué)、免疫學(xué)特性結(jié)合法富集 Chen等[7]開發(fā)了一種將基于尺寸微孔濾過的物理法和免疫法結(jié)合的微流控制裝置，成功提高了CTCs的捕獲效率，高達(dá)87.2%～93.5%。Su等[8]融合細(xì)胞尺寸大小和表面特異性抗原特性設(shè)計(jì)出一種“過濾芯片”，利用表面涂有氧化鋅納米結(jié)構(gòu)微球提高CTCs捕獲效率，再通過“過濾芯片”捕獲、分離、檢測CTCs,這種具有抗體功能微球集成芯片使得CTCs檢出率高達(dá)90%以上，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在PC診療中的應(yīng)用

超過80%的PC在確診時(shí)已處于中晚期，根治性手術(shù)切除率低，且術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。有學(xué)者認(rèn)為，PC致死率居高不下的原因有以下幾點(diǎn)；(1)胰腺解剖位置隱匿，癥狀不典型，早期診斷困難，即發(fā)生轉(zhuǎn)移和全身惡病質(zhì)的表現(xiàn)[9]。(2)對(duì)放療、化療不敏感，目前缺乏有效的非手術(shù)治療方法。(3)早期手術(shù)能明顯改善預(yù)后，對(duì)于直徑≤1 cm的微小PC(也稱為早期PC)術(shù)后5年生存率可達(dá)70%～100%[10]，因此早發(fā)現(xiàn)、早手術(shù)對(duì)有效治療PC、改善預(yù)后有重要意義。

2.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與PC的診斷 早期診斷困難和缺乏有效個(gè)體化治療方案是PC預(yù)后差的最主要原因，近年來，CTCs作為PC輔助診斷指標(biāo)的研究取得重大成就，劉艷輝等[11]采用免疫磁珠負(fù)性富集結(jié)合免疫熒光方法分離和鑒定CTCs，在PC診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CTCs是PC診斷的敏感指標(biāo)，聯(lián)合CA19-9與CTCs可顯著提高PC的診斷水平。吳斌等[12]對(duì)國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，對(duì)CTCs在PC中診斷價(jià)值進(jìn)行分析，經(jīng)過篩選總計(jì)19項(xiàng)研究693例PC患者和406例非PC患者被納入，研究認(rèn)為目前CTCs尚不足以單獨(dú)作為PC早期診斷指標(biāo)，但可作為PC診斷方法的重要補(bǔ)充。Martini等[13]為評(píng)估CTCs在PC中的診斷應(yīng)用價(jià)值，以關(guān)鍵詞“循環(huán)腫瘤細(xì)胞、PC、診斷與預(yù)后”對(duì)1999—2019年的研究報(bào)道進(jìn)行回顧，發(fā)現(xiàn)不同的富集方法檢出率差異較大，但CTCs在PC患者外周血中均可檢測到，CTCs有望成為診斷PC的一種工具。

2.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與PC的預(yù)后 CTCs對(duì)PC的預(yù)后有著非常好的評(píng)估意義，即使是腫瘤灶可切除性患者，術(shù)前外周血中檢測出CTCs預(yù)后也顯著差于未檢測出者[14]。有學(xué)者對(duì)PC患者外周血是否存在CTCs與患者的術(shù)后復(fù)發(fā)、生存期的關(guān)系進(jìn)行分析，研究證實(shí)檢測出CTCs的腫瘤灶切除性PC患者生存期明顯縮短，術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著增高[15]。Yin等[16]發(fā)現(xiàn)，在新輔助治療病理完全緩解PC患者外周血中依然存在CTCs,而且認(rèn)為可以作為預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)及生存期縮短的生物學(xué)指標(biāo)。Wang等[17]對(duì)2019年以前所有關(guān)于CTCs在PC預(yù)后作用價(jià)值的報(bào)道進(jìn)行Meta分析，總計(jì)19項(xiàng)研究共1320例患者被納入，研究結(jié)果表明，CTCs陽性PC患者總生存期和無進(jìn)展生存期均顯著短于CTCs陰性患者，CTCs可以作為PC治療前評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)志物。Mandair等[18]利用cellseacrh系統(tǒng)確定了胰腺內(nèi)分泌腫瘤轉(zhuǎn)移性(panNETs)的最佳閾值為1個(gè)/7.5 ml?；诒姸喑晒ρ芯繄?bào)道，Chapman等[19]利用超聲引導(dǎo)下內(nèi)鏡采集門靜脈血(PV)CTCs，評(píng)估其在PC預(yù)后方面的價(jià)值，研究證實(shí)PV-CTCs可以作為預(yù)測PC無進(jìn)展生存期和總生存期的生物標(biāo)志物。此外CTCs在向轉(zhuǎn)移播散的過程中伴隨著形態(tài)的改變，空間異質(zhì)性也可以作為監(jiān)測腫瘤灶轉(zhuǎn)移及評(píng)估預(yù)后的標(biāo)志物[20]。甚至可以作為判斷PC預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[21]。

2.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與PC的療效評(píng)估 在抗癌治療的打擊和腫瘤灶自然進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)下，腫瘤細(xì)胞不斷地進(jìn)行突變性增殖，耐藥性不斷增強(qiáng)，這就需要不斷調(diào)整抗癌治療方案；Labib等[22]利用胰腺腫瘤細(xì)胞移植小鼠模型進(jìn)行單腫瘤細(xì)胞層面研究，發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)或治療反應(yīng)蛋白可以被鑒別，且這些突變蛋白可以預(yù)測治療藥物的敏感性和耐藥性。傳統(tǒng)的穿刺活檢屬于侵入性有創(chuàng)操作，難以發(fā)現(xiàn)腫瘤灶內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性，也不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測；但外周血中實(shí)時(shí)檢測CTCs能動(dòng)態(tài)反映腫瘤灶內(nèi)細(xì)胞變化，及時(shí)選擇有效的抗癌治療，從而達(dá)到最佳治療效果。Sheng等[23]對(duì)3例VI期PC 患者進(jìn)行化療監(jiān)測，使用CT進(jìn)行療效評(píng)估的同時(shí)對(duì)患者CTCs進(jìn)行檢測，當(dāng)CT顯示化療有效，腫瘤灶縮小時(shí)，CTCs計(jì)數(shù)也隨之降低，因此CTCs計(jì)數(shù)有望成為新的療效觀察指標(biāo)。Rivera-Baez等[24]利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成功擴(kuò)增與PC細(xì)胞KRAS突變一致的細(xì)胞系，并評(píng)估了擴(kuò)增細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)移的潛能并檢驗(yàn)了細(xì)胞系用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的效用，對(duì)轉(zhuǎn)化型PC研究提供有價(jià)值的資源，也為PC的轉(zhuǎn)移和耐藥性提供有意義的指導(dǎo)。

2.4 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與PC的治療 靶向治療的廣泛應(yīng)用增添了“活檢”的使用途徑，對(duì)于需要進(jìn)行新輔助治療的可切除腫瘤灶PC患者而言，傳統(tǒng)組織活檢最主要的用途就是建立一個(gè)組織診斷，以指導(dǎo)術(shù)后的輔助治療，然而要想實(shí)時(shí)檢測以指導(dǎo)治療傳統(tǒng)活檢顯然是不可行的。HER2(human epithelial growth factor receptor 2)在腫瘤生物學(xué)中的作用已在多種腫瘤中被報(bào)道，基于HER2的靶向療法已經(jīng)顯示出顯著療效，Nagarkar等[25]從血液中分離CTCs進(jìn)行擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)分析，確定了HER2基因的過表達(dá)并以過表達(dá)蛋白作為治療靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出帶有曲妥珠單抗、環(huán)磷酰胺和氨甲蝶呤的個(gè)性化治療方案，并取得相當(dāng)好的抗癌療效，充分顯示了CTCs在抗癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。Wang等[26]開發(fā)了一種經(jīng)濟(jì)有效的靜脈導(dǎo)管降低CTCs負(fù)荷，導(dǎo)管表面經(jīng)EpCAM抗體修飾，在外周血循環(huán)驅(qū)動(dòng)下，利用抗原-抗體反應(yīng)富集CTCs,再經(jīng)近紅外光殺滅，有效預(yù)防PC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。針對(duì)異質(zhì)性CTCs為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”學(xué)說，F(xiàn)ranses等[27]利用CTC-iChip富集CTCs并對(duì)PC患者CTCs進(jìn)行了全面轉(zhuǎn)錄分析，確定了相關(guān)基因片段，最終發(fā)現(xiàn)LIN28B的表達(dá)與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，通過細(xì)胞及動(dòng)物模型從異質(zhì)性CTCs中尋找到治療靶點(diǎn)，成功開發(fā)了針對(duì)轉(zhuǎn)移“種子”的靶向療法。

3 展 望

全世界基因、表達(dá)譜及蛋白組學(xué)分析方法的快速發(fā)展使得尋找具有直接治療作用的生物標(biāo)志物成為可能，這些為PC的精準(zhǔn)治療提供了非常好的治療途徑。外周血CTCs檢測突破了傳統(tǒng)穿刺活檢的局限性，通過微創(chuàng)、低成本、高效、實(shí)時(shí)采集的技術(shù)手段獲取信息，以監(jiān)測腫瘤灶的進(jìn)展、細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)及尋找治療靶點(diǎn)[28]；對(duì)于中晚期PC患者而言，個(gè)性化、精準(zhǔn)化治療方案是提高其生存期的最有效方法[29]，例如，定向基因治療CRISPR/Cas9技術(shù)[30]通過敲入或敲除特定基因從而干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及降低細(xì)胞生長、遷移、侵襲和藥物抵抗，延緩患者的生存期。盡管CTCs在PC的診療中價(jià)值不菲，但應(yīng)用于臨床依然還有較多問題：(1)CTCs的應(yīng)用關(guān)鍵在于其檢測技術(shù)，目前的檢測方法眾多，不同的檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，檢出率層差不齊；(2)CTCs在計(jì)數(shù)上的最佳閾值有待進(jìn)一步研究，異質(zhì)性與PC的關(guān)系有待進(jìn)一步大規(guī)模多中心研究；(3)基于CTCs的分子靶向治療目前還處于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段。