上調(diào)脂蛋白酯酶基因?qū)穹至寻Y大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

佘 意，余軍軍，呂 媛

(1.湖南省第二人民醫(yī)院精神科，中國 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，分子流行病學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國 長(zhǎng)沙 410013)

精神分裂癥屬于一種較為常見的精神疾病，該病以精神活動(dòng)與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征表現(xiàn)，患者多存在思維、知覺、情感及行為障礙，目前臨床上認(rèn)為遺傳學(xué)變異、表現(xiàn)遺傳突變、環(huán)境因素相互作用下誘導(dǎo)精神分裂癥的發(fā)生，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確[1]。研究表明，脂蛋白脂酶(LPL)為甘油三酯水解過程中的一種關(guān)鍵酶，其廣泛存在于大腦組織中的認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)等區(qū)域中，屬于血脂異常、冠心病、阿爾茲海默病的高危影響因素之一[2]?；谏鲜鲅芯勘尘埃疚难芯可险{(diào)LPL基因?qū)穹至寻Y大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制，以明確LPL基因與精神分裂癥的作用關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取60只SPF級(jí)SD雄性大鼠，8～12周齡，購自慕恩(廣州)生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2020-0225，體重185～220 g，所有大鼠均在相對(duì)濕度為30%～50%、溫度為(23.8±1.5)℃的環(huán)境下預(yù)喂養(yǎng)7 d，每日光照12 h，分籠飼養(yǎng)。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

主要試劑：LPL載體構(gòu)建及慢病毒載體滴定由上海吉瑪公司完成；MK801購自美國Sigma公司；小鼠抗大鼠CREB抗體、兔抗大鼠p-CREB抗體、兔抗人BDNF抗體、兔抗大鼠TrkB抗體、小鼠抗大鼠p-TrkB抗體購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 LPL載體構(gòu)建 使用GenBank查找序列獲得LPL基因序列，構(gòu)建LPL下調(diào)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、LPL上調(diào)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，并做慢病毒滴度測(cè)定(病毒滴度為1×1012TU·L-1)。LPL引物序列:上游:5’-CTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGT-3’，下游：5’-ACTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’;LPL引物序列:上游:5’-CGCTTCTTTGCCAACATCGT-3’，下游：5’-ACACTCCATGCTGTCATCTTGA-3’。

1.2.2 分組及建模 將所選取的60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、下調(diào)組、上調(diào)組各15只，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠參照房茂勝等[3]研究中精神分裂癥模型的建立方法構(gòu)建精神分裂癥大鼠模型，取MK801，在使用前先稀釋為0.1 g·L-1的注射藥液，在恒溫狀態(tài)下水浴震蕩20 min，在每日9：00～10:00將0.3 μg·g-1的MK801注射于大鼠左或者右下側(cè)腹腔略靠近外科1/3處(左、右側(cè)每日交替)，連續(xù)注射1周。正常組注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 LPL慢病毒載體滴定 建模成功后在下調(diào)組大鼠海馬組織注射含10 μL LPL的下調(diào)質(zhì)粒慢病毒懸液，上調(diào)組大鼠海馬組織注射含10 μL LPL的上調(diào)質(zhì)粒慢病毒懸液。正常組、模型組大鼠注射等量生理鹽水。7 d后觀察大鼠變化。

1.2.4 LPL慢病毒載體滴定效率鑒定 在LPL慢病毒載體滴定完成7 d后隨機(jī)取各組中3只大鼠使用5%苯巴比妥做常規(guī)腹腔注射麻醉后處死，迅速取海馬組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LPL慢病毒載體滴定效率，提取并鑒定海馬組織總RNA含量、純度，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。以U6為內(nèi)參照，LPL上游序列5’-AGCTGTGCCTGTGATTGTAGCATTC-3’，下游序列：5’-AACATGTGAGTAAGGCTGCCACTAG-3’；U6上游序列5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3’，下游序列5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.5 刻板行為評(píng)分 依照Sams Dodd和Hoffman標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)各組大鼠進(jìn)行刻板行為評(píng)分，10 min·次-1，觀察60 min，共6次，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：大鼠靜止不動(dòng)，無活動(dòng)或者幾乎不活動(dòng)；1分：大鼠正常活動(dòng)，偶爾有向前的運(yùn)動(dòng)；2分：大鼠活動(dòng)并伴隨著反復(fù)向前探索現(xiàn)象；3分：大鼠活動(dòng)并持續(xù)向前探索；4分：大鼠存在重復(fù)旋轉(zhuǎn)、抬頭、搖頭表現(xiàn)；5分：大鼠出現(xiàn)快速搖頭、轉(zhuǎn)圈或者頭的背腹運(yùn)動(dòng)。

1.2.6 共計(jì)失調(diào)評(píng)分 對(duì)各組大鼠進(jìn)行共濟(jì)失調(diào)評(píng)分[5]，10 min·次-1，觀察60 min，共6次，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)；1分：大鼠存在輕度搖晃現(xiàn)象，搖擺運(yùn)動(dòng)，豎立不倒；2分：大鼠存在中度的不協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，偶爾跌倒；3分：大鼠無力支撐體重，爬行運(yùn)動(dòng)；4分：大鼠無運(yùn)動(dòng)，躺向一邊。

1.2.7 水迷宮試驗(yàn) 采用水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠平均逃避潛伏期、穿越原平臺(tái)位置次數(shù)連續(xù)測(cè)量3次，取均值。

1.2.8 樣本采集 在各組大鼠上述操作完成后，使用5%苯巴比妥做常規(guī)腹腔注射麻醉后處死，立即取海馬組織，分為均勻3等份，其中1等份做組織切片行病理組織學(xué)觀察，另外兩份在液氮中保存用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.9 病理組織學(xué)觀察 取所制備的海馬組織，固定1 d后，使用酒精脫水、二甲苯透明處理后做常規(guī)石蠟包埋，做5 μm切片，做HE染色，樹膠封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠海馬組織病理變化。

1.2.10 Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)指標(biāo)檢測(cè) 取1等份液氮中所保存的海馬組織，采用分光光度計(jì)檢測(cè)海馬組織中NO活性和MDA含量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織中nNOS mRNA表達(dá)量；采用HPLC-ECD法測(cè)定海馬組織中DA和Glu水平。

1.2.11 海馬組織CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)大鼠海馬組織CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB表達(dá)量，取1等份液氮中所保存的海馬組織，將所制備的海馬組織做10 000×g離心處理10 min，提取上清液，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況，內(nèi)參為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPL基因轉(zhuǎn)染效率鑒定

如表1所示，與正常組相比，模型組、下調(diào)組LPL基因表達(dá)量降低，上調(diào)組LPL基因表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 LPL基因轉(zhuǎn)染效率鑒定

2.2 各組大鼠刻板行為評(píng)分、共計(jì)失調(diào)評(píng)分、平均逃避潛伏期、穿越原平臺(tái)位置次數(shù)比較

如表2所示，與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組刻板行為評(píng)分、共計(jì)失調(diào)評(píng)分、平均逃避潛伏期升高，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、下調(diào)組相比，上調(diào)組刻板行為評(píng)分、共計(jì)失調(diào)評(píng)分、平均逃避潛伏期降低，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠刻板行為評(píng)分、共計(jì)失調(diào)評(píng)分、平均逃避潛伏期、穿越原平臺(tái)位置次數(shù)比較

2.3 病理組織學(xué)觀察

如圖1所示，正常組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，海馬神經(jīng)元細(xì)胞(箭頭處)正常；模型組大鼠海馬神經(jīng)元變性，細(xì)胞核固縮(箭頭處)，神經(jīng)元細(xì)胞層減少；下調(diào)組大鼠海馬神經(jīng)元變性，存在較為明顯的細(xì)胞核固縮現(xiàn)象(箭頭處)，神經(jīng)元細(xì)胞層明顯減少。上調(diào)組大鼠存在局灶性的神經(jīng)元變性現(xiàn)象，少量細(xì)胞核固縮(箭頭處)，組織學(xué)正常。

圖1 病理組織學(xué)觀察(HE×400)Fig. 1 Histopathological observation (HE×400)

2.4 各組大鼠Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)指標(biāo)比較

如表3所示，與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組NO活性、MDA含量、nNOS mRNA、DA水平升高，Glu水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、下調(diào)組相比，上調(diào)組NO活性、MDA含量、nNOS mRNA、DA水平降低，Glu水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)指標(biāo)比較

2.5 各組大鼠海馬組織中CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

如表4所示，與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組的CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB蛋白表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、下調(diào)組相比，上調(diào)組的CREB，p-CREB，BDNF，TrkB及p-TrkB蛋白表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織中CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

圖2 CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路蛋白表達(dá)WB圖 Fig. 2 WB graph of protein expression of CREB/BDNF/TrkB signaling pathway

3 討論

目前臨床上對(duì)于精神分裂癥的具體發(fā)病機(jī)制仍處于不斷研究中，尚不完全明確，認(rèn)為此病的發(fā)生與神經(jīng)細(xì)胞膜相關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞膜主要包括花生四烯酸、二十二碳六烯酸，在神經(jīng)發(fā)育的過程中多不飽和脂肪酸水平降低可增強(qiáng)血清、腦組織中PLA2的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)精神分裂癥的發(fā)生。

LPL基因定位于染色體8p22上，其長(zhǎng)度大約為36 000 bp，由9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子所構(gòu)成，在脊髓、大腦、外周神經(jīng)中廣泛存在，當(dāng)大腦損傷或者周圍神經(jīng)阻滯供血被阻斷后LPL含量顯著升高，修復(fù)損傷的神經(jīng)組織[6-8]。臨床表明精神分裂癥的發(fā)生與人染色體8p22區(qū)域相關(guān)，而LPL基因同樣定位于染色體8p22上，因此推測(cè)LPL基因與精神分裂癥可能相關(guān)。但目前臨床上對(duì)于LPL基因與精神分裂癥的關(guān)系研究較少，僅有邢洪源等[2]發(fā)現(xiàn)LPL基因mRNA在精神分裂癥模型大鼠腦組織中的低表達(dá)。基于此背景，本文推測(cè)LPL基因可能作為精神分裂癥的靶點(diǎn)。上調(diào)和下調(diào)LPL基因?qū)穹至寻Y動(dòng)物模型的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPL基因與精神分裂癥相關(guān)，上調(diào)LPL基因可阻止海馬組織進(jìn)一步受損，抑制疾病進(jìn)展。

CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)，維持神經(jīng)系統(tǒng)功能，其中BDNF屬于一種較為重要的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其在神經(jīng)元生長(zhǎng)分化、突出可塑性、抗神經(jīng)元凋亡等過程中具有重要的意義[9]。而CREB屬于BNDF的上游轉(zhuǎn)錄因子，其具有對(duì)多種記憶相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)功能，其自身及磷酸化后均會(huì)在一定程度上抑制BDNF表達(dá)，促進(jìn)BDNF下游調(diào)控因子TrkB磷酸化[10]。Guo等[11]在其研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路可改善精神分裂癥認(rèn)知障礙。神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂與精神分裂癥發(fā)生后的海馬神經(jīng)元損失相關(guān)，Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在精神分裂癥發(fā)生后出現(xiàn)明顯的紊亂表現(xiàn)[12]。本文結(jié)果顯示，上調(diào)LPL基因可能經(jīng)激活CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路，穩(wěn)定Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，發(fā)揮其改善精神分裂癥認(rèn)知的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)LPL基因后可在一定程度上修復(fù)精神分裂癥大鼠海馬組織損傷，其作用機(jī)制可能與激活CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路，穩(wěn)定Glu-DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，改善NO，MDA，nNOS，DA及Glu異常表達(dá)相關(guān)。但由于本研究動(dòng)物樣本數(shù)量有限，該結(jié)論尚需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。