‘弗雷無核’胚挽救適宜接種期研究

張愛華 陳 虎 陳紅梅

（石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院葡萄研究所 新疆石河子832000）

目前無核葡萄在國外葡萄市場上占據(jù)絕對的主導(dǎo)地位。在我國隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，以及消費(fèi)市場的日趨成熟，無核葡萄也越來越受到消費(fèi)者的青睞，種植面積不斷增加，市場對不同類型品種的需求日漸豐富多元化。因此培育優(yōu)質(zhì)無核葡萄品種，已成為葡萄育種的主流方向。傳統(tǒng)的育種方法，為避免無核葡萄合子胚敗育，只能用有核葡萄品種作為母本、無核品種作為父本進(jìn)行雜交。這種方法，僅能產(chǎn)生較少的無核后代，效率非常低，平均僅為13.5%[1]。而使用胚培養(yǎng)技術(shù)，則可以使用無核葡萄作母本，有核、無核葡萄均可以作父本雜交，既可以極大拓寬親本的選擇范圍，同時也可以簡化育種程序，提高了后代的無核率，胚的離體培養(yǎng)使無核葡萄的育種周期縮短，對無核葡萄的育種有極大的促進(jìn)作用。1982 年RAMMING等[2]率先發(fā)明胚挽救技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)無核葡萄作為雜交母本，從而大幅提高無核后代的比例，使得這項(xiàng)葡萄育種技術(shù)得到更廣泛的推廣與普及應(yīng)用。國內(nèi)外專家學(xué)者也正在利用這種手段進(jìn)行無核葡萄的選育，到目前為止，法國、美國、日本等許多國家創(chuàng)造出了大量的無核葡萄新品種種質(zhì)。我國部分高校和科研院所自20 世紀(jì)80 年代中后期開始引進(jìn)發(fā)展該技術(shù)，在無核葡萄的胚培養(yǎng)技術(shù)方面做了大量的工作。目前，通過胚挽救技術(shù)已選育出了數(shù)十種新的無核葡萄品系，并培育出一些新種質(zhì)[3]。

‘火焰無核’葡萄又稱‘弗蕾無核’，歐亞種，原產(chǎn)美國，由美國Fresno 園藝試驗(yàn)站雜交選育而成。1993年新疆葡萄瓜果開發(fā)研究中心將其作為資源引入新疆，1998-2001 年 3 年品比試種，獲得好評[4]。2001 年大量擴(kuò)繁推廣，目前已成為新疆推廣面積較大的無核品種之一。據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)梁樹樂等人研究，以火焰無核為母本進(jìn)行胚培養(yǎng)，胚萌發(fā)率以及成苗率明顯高于其他10 個無核品種。因此本研究采用弗雷無核做母本，本地自育與外引品種做父本配置組合，做進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019 年在石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院葡萄所試驗(yàn)園進(jìn)行，供試母本材料是8 年‘弗雷無核’，3～5 個中部果穗掛牌，去雄后分別與本所資源圃多年生‘無核白雞心’‘紫香無核’‘夏至紅’‘粉紅亞都蜜’葡萄進(jìn)行雜交，獲得雜交組合。

1.2 研究方法

1.2.1 花粉的采集 在2019 年5月中旬進(jìn)行，在父本初花期時，選取生長健壯、飽滿的花穗，將花藥剝離后在自然條件下陰干，用研缽碾成粉末狀，裝入玻璃瓶中備用。

1.2.2 授粉 選擇‘弗雷無核’母本開花前3～4 d，完成去雄，去雄過程中適當(dāng)去除部分過小和發(fā)育不全的花或花序。去雄后立即套袋，當(dāng)大部分花的柱頭上出現(xiàn)水滴狀液體時授粉最佳，連續(xù)授粉3 d，授粉后及時套袋并做好標(biāo)記。

1.2.3 胚珠取樣時間 胚挽救技術(shù)難度較大，需要嚴(yán)格操作，并且胚的萌發(fā)率受到很多因素的影響。其中接種時間是最為重要的因素，所以確定胚珠接種的最佳時期，是胚挽救成功的前提和關(guān)鍵，當(dāng)胚發(fā)育程度最高且尚未敗育時接種效果最好。

本研究主要對‘弗雷無核’胚珠的采樣時間做了不同的處理，分別在授粉后 35 d、40 d、45 d、50 d。

1.2.4 胚珠的離體培養(yǎng) 將雜交果穗采集后剪成果粒放入廣口瓶中，首先用自來水沖洗30 min，無菌水沖洗3 次，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 次，有效氯含量0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，最后用無菌水沖洗3 次。

從消毒處理后的果實(shí)中取出胚珠，接種到150 mL三角瓶中，每瓶約20 粒，胚珠發(fā)育培養(yǎng)基是（MM3+60 g/L 蔗糖+0.5 g/L 水解酪蛋白+0.1 g/L 肌醇+3 g/L活性炭+7 g/L 瓊脂）[5]，暗培養(yǎng) 60 d。不同處理各取 5 瓶，統(tǒng)計(jì)胚珠發(fā)育數(shù)。

1.2.5 胚萌發(fā)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 將幼胚從暗培養(yǎng)完成后的胚珠中取出，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基 （WPM+20 g/L 蔗糖+0.2 g/L 6-BA+0.1 g/L 肌醇+1.21 g/L 半胱氨酸+1.5 g/L 活性炭+7 g/L 瓊脂）中，培養(yǎng)溫度為25～28℃，光強(qiáng)度 2 000 Lx,光照時間 12 h。統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)數(shù)及成苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 母本均為無核品種

隨著時間的推移，發(fā)育數(shù)、萌發(fā)數(shù)、成苗數(shù)先增加后降低，由此表明該組合授粉后45 d 左右，胚珠發(fā)育最充分，萌發(fā)率、成苗率也最高，隨著時間的推移，其胚珠逐漸退化，活力也隨著下降。當(dāng)授粉天數(shù)達(dá)到50 d 時發(fā)育率下降，萌發(fā)率、成苗率都降為0，開始轉(zhuǎn)向急劇敗育（表1）。

2.2 父本均為有核品種

從表2 可以看出，有核雜交組合胚的發(fā)育率、萌發(fā)率、成苗率也是在授粉后的第45 d 達(dá)到最大，因此適宜接種時間也為授粉后45 d，與無核父本基本一致。

綜合表1 和表2 表明，由‘弗雷無核’作母本的雜交組合，父本有核雜交組合后代發(fā)育率、萌發(fā)率、成苗率，與無核父本無明顯差別，但不同親本差異顯著，‘紫香無核’各指標(biāo)顯著高于其他品種20%以上。因此基因型對后代個體發(fā)育指標(biāo)影響遠(yuǎn)高于品種有核、無核的影響。

表2 有核組合不同采樣時期生長發(fā)育調(diào)查

3 討論

無核葡萄胚發(fā)育嚴(yán)格受基因型控制決定。同一品種不同年份、不同地域、不同氣候、不同部位，其胚發(fā)育期略有不同，但基本存在著發(fā)育率和成苗率先增后減趨勢，在某一固定時間段，保持較高的發(fā)育率和成苗率。當(dāng)胚發(fā)育階段較高，較為成熟，進(jìn)行體外培養(yǎng)，相對簡單易于獲得再生后代。一般認(rèn)為，當(dāng)胚發(fā)育程度最高，最完善，且尚未敗育時接種效果最好。因此研究胚敗育過程，確定適宜的接種時間，是胚挽救成功的前提和核心環(huán)節(jié)。由表1、表2 可以看出，由弗雷無核做母本的雜交組合，取樣時間基本取決于母本。其適宜取樣時間為授粉后的第45 d 左右。父本無論有核還是無核還是不同品種，取樣時間沒有顯著差別。由于本試驗(yàn)是單品種、單年、單點(diǎn)試驗(yàn)，未能充分綜合氣候、種植、技術(shù)水平等影響，單純以開花后天數(shù)定義適宜時間，存在著一定的不穩(wěn)定性和不確定性。因此結(jié)合與胚發(fā)育密切相關(guān)的著色期等形態(tài)特征指標(biāo)綜合確定適宜的胚挽救適宜時期更為準(zhǔn)確，符合育種實(shí)際。