響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶對麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒的澄清效果

王 凱，黃 鈺，程 浩，武紀(jì)天，李 楠

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

麥芽別稱穬麥蘗（《名醫(yī)別錄》），《名醫(yī)別錄》“麥穬”條云：“作蘗，溫，消食和中?！庇眠m量水浸泡麥粒，使其處于適宜的濕度和溫度，幼芽長到約0.5 cm，干燥即可制得麥芽。麥芽味道甘甜，其性偏暖，具有潤氣消食、健脾歸中等功效，長期服用可對脾虛食少者身體恢復(fù)產(chǎn)生良好效果[1-2]。

小麥胚芽是面粉加工的副產(chǎn)品，大多數(shù)在生產(chǎn)過程中廢棄，得不到有效利用。小麥胚芽可用作飼料，其含有多種營養(yǎng)素(如優(yōu)質(zhì)蛋白、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等)，還有多種生理活性物質(zhì)(如麥胚凝集素、谷胱甘肽、黃酮類物質(zhì)、二十八烷醇等)[3]。目前研究表明，小麥胚芽已被較多用于食品方面的研究，例如生產(chǎn)飲料[4]、制作新品納豆[5]、保護(hù)熟魚片油穩(wěn)定性[6]等。

纖維素酶由于可以分解纖維素，在生物醫(yī)藥、食品研發(fā)、造紙行業(yè)等領(lǐng)域中受到廣泛使用。程浩等[7]以桂林月柿為原料發(fā)酵釀造柿子醋,在澄清過程中添加纖維素酶，澄清效果良好。陳智理等[8]通過單因素和正交試驗,對纖維素酶和果膠酶酶解處理香蕉果酒的得率和澄清度進(jìn)行試驗，在最優(yōu)條件組合下酶解后香蕉果酒的得率和透光率的綜合評價指標(biāo)為91.1%。BARBOSA K L等[9]分離、篩選和部分鑒定甘蔗螟蟲腸道中存在的細(xì)菌纖維素酶，以期將纖維素酶作為一種醫(yī)用抑制劑。目前關(guān)于纖維素酶對于麥芽-麥胚芽酒的澄清研究尚未報道，本試驗以萌發(fā)麥芽以及小麥胚芽為原料釀造麥芽-麥胚芽酒，加入纖維素酶進(jìn)行澄清，在單因素實驗基礎(chǔ)上，以澄清時間、澄清溫度、纖維素酶添加量為自變量，透光率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化麥芽-麥胚芽酒澄清工藝，以獲得澄清的發(fā)酵酒，為麥芽和小麥胚芽應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

麥芽與麥胚芽，市售；麥芽-麥胚芽酒，本實驗室發(fā)酵自制；釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司。

儀器與設(shè)備：恒溫水浴鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SN510C 全自動高壓滅菌鍋，重慶雅瑪拓科技有限公司；SHP-250 生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JJ-2 組織搗碎機(jī)，常州迅生儀器有限公司；YP201N電子天平，上海菁華科技儀器有限公司；PL-303 分析天平，METTLER TOLEDO 有限公司；UVmini-1240 紫外-可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽-麥胚芽酒的釀造工藝

麥芽精選→組織搗碎機(jī)粉碎→加入麥胚芽（麥芽與麥胚芽質(zhì)量比2.5∶1）→加水混勻（料液體積比1∶3）→65 ℃糖化→取上清液→高溫滅菌→接種→28 ℃發(fā)酵7 d（酵母活化）→酒渣分離→澄清過濾→原酒→殺菌灌裝→成品

1.2.2 單因素澄清實驗

澄清時間對澄清效果的影響：將纖維素酶按照400 mg/L 質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒中，充分搖勻，45 ℃水浴條件下分別澄清0、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h 后取出，室溫靜置2 d 后離心取上清液在波長750 nm下測定透光率[10]。

澄清溫度對澄清效果的影響：將纖維素酶按照400 mg/L 質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒中，充分搖勻，分別設(shè)置溫度為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃的水浴條件，澄清6 h 后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

纖維素酶添加量對澄清效果的影響：將纖維素酶按照0、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L 質(zhì)量濃度加入到麥芽-麥胚芽發(fā)酵酒中，充分搖勻，45 ℃水浴條件下澄清6 h 后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化澄清工藝

根據(jù)單因素實驗所得數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化澄清工藝，以澄清時間（A）、澄清溫度（B）、纖維素酶添加量（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3 水平試驗進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行響應(yīng)面分析，并驗證結(jié)果的可靠程度。響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1 澄清工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設(shè)計因素與水平

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

單因素實驗過程中取3 次平行進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)通過Origin2017 版繪圖軟件進(jìn)行展示。響應(yīng)面法采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵酒澄清工藝優(yōu)化單因素實驗

2.1.1 澄清時間對澄清效果的影響（圖1）

圖1 時間與澄清效果的關(guān)系

由圖1 可知，發(fā)酵酒的透光率隨著澄清時間的延長先增高后下降，在0～6 h澄清時間范圍內(nèi)逐漸增大，在6～15 h 澄清時間范圍內(nèi)逐漸下降。出現(xiàn)先增大后下降的原因是由于澄清時間過短，酶作用時間不夠充裕，在較短的時間內(nèi)不能澄清酒體中的纖維素類物質(zhì)；若澄清時間過長，已經(jīng)絮凝的物質(zhì)會重新溶解到體系中，導(dǎo)致透光率的下降。透光率在澄清時間為6 h 時達(dá)到最大，可達(dá)87.4%，因此采用澄清時間為6 h進(jìn)行澄清。

2.1.2 澄清溫度對澄清效果的影響（圖2）

圖2 溫度與澄清效果的關(guān)系

由圖2 可知，隨著溫度的升高，透光率呈現(xiàn)出先增大后下降的趨勢，在30～45 ℃澄清溫度范圍內(nèi)逐漸增大，在45～55 ℃澄清溫度范圍內(nèi)逐漸下降。導(dǎo)致透光率呈現(xiàn)上述變化趨勢的原因是，在較低溫度條件下，酶達(dá)不到比較適宜的溫度，其澄清效果欠佳，對于酒體中大分子物質(zhì)澄清不徹底；在較高溫度條件下，由于溫度較高，超過了酶作用的最適溫度，酶活下降，并且較高的溫度酒體分子熱運動也更為明顯，從而導(dǎo)致酒體透光率下降。透光率在澄清溫度為45 ℃時達(dá)到最大，可達(dá)87.8%，因此采用澄清溫度為45 ℃進(jìn)行澄清。

2.1.3 纖維素酶添加量對澄清效果的影響（圖3）

圖3 纖維素酶添加量與澄清效果的關(guān)系

由圖3 可知，隨著纖維素酶添加量的逐漸增多，透光率的變化趨勢為先增大后下降。在0～400 mg/L 纖維素酶添加量范圍內(nèi)，透光率隨著添加量的增多而增大，在400～700 mg/L 纖維素酶添加量范圍內(nèi)，透光率隨著添加量的增多而下降。造成這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是，在酶添加量較低的范圍內(nèi)，酶的總量能使酒體達(dá)到較好的澄清效果；當(dāng)酶添加量達(dá)到較高范圍時，過量的澄清劑使得酒體中更易產(chǎn)生二次渾濁，從而影響穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致酒體透光率的下降。透光率在纖維素酶添加量為400 mg/L 時達(dá)到最大，可達(dá)88.7 %，因此采用纖維素酶添加量400 mg/L進(jìn)行澄清。

2.2 發(fā)酵酒澄清工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及分析

在單因素實驗所得數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Benhnken 試驗設(shè)計，以澄清時間（A）、澄清溫度（B）、纖維素酶添加量（C）3 個因素為自變量，以透光率（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert V8.0.6 軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合及分析。響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表2，模型分析見表3。

利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，所得自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程如下：

由表3可知，模型P值=0.0001＜0.01，達(dá)到極顯著水平，說明響應(yīng)面試驗所得模型可靠，擬合性良好，可用于后續(xù)優(yōu)化；失擬項P 值=0.2955＞0.05，顯著水平為不顯著，表明方程擬合良好，未出現(xiàn)失擬現(xiàn)象，試驗方法可靠性高；因素A、C 的P 值均小于0.01，說明澄清時間與纖維素酶添加量對麥芽-麥胚芽酒的澄清效果影響是極顯著的，而因素B 的P值=0.0151＜0.05，表明澄清溫度對麥芽-麥胚芽酒澄清效果影響是顯著的；交互項AB 的P 值=0.0145＜0.05，說明此交互項AB對酒體澄清效果具有顯著影響，而交互項AC、BC 的P 值均大于0.05，說明交互項AC、BC 對酒體澄清未達(dá)到顯著影響；A2、B2、C2均小于0.01，表明A2、B2、C2對酒體澄清效果影響極顯著。由F 值可知因素C＞A＞B，表明所選取的3 個因素對酒體澄清效果的影響順序為：纖維素酶添加量＞澄清時間＞澄清溫度。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

表4 方差相關(guān)系數(shù)

由表4 可知，擬合度R2=0.9727，校正擬合度R2Adj=0.9376，兩者數(shù)值較接近，表明所建立的模型與實際試驗擬合性良好，準(zhǔn)確性高；預(yù)測擬合度R2Pred=0.7340，表明模型預(yù)測性良好；變異系數(shù)CV（%）=1.22＜5.0%，表明方程的可重現(xiàn)性良好[11]；信噪比=13.857＞4.0，表明試驗精密度高，模型可信度高。綜上所述，可利用此模型進(jìn)行分析各因素變化對響應(yīng)值的影響，并預(yù)測其變化規(guī)律。

2.2.2 各影響因素交互作用分析（圖4）

由圖4A 可知，在纖維素酶添加量一定時，隨著澄清時間的延長與澄清溫度的升高，透光率呈現(xiàn)出先增大后下降的趨勢，且等高線圖呈現(xiàn)為明顯的橢圓形。兩種因素在較低范圍內(nèi)增加時，透光率逐漸增大；當(dāng)兩種因素增加到較高范圍時，又會導(dǎo)致透光率的降低。這表明交互項AB對透光率的影響是顯著的。

由圖4B 可知，在澄清溫度一定時，隨著澄清時間的延長與纖維素酶添加量的增加，透光率呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢，等高線圖呈現(xiàn)為較接近圓形，顯著性不明顯[12]。這表明交互項AC 對透光率的影響不顯著。

由圖4C 可知，在澄清時間一定時，隨著澄清溫度的升高與纖維素酶添加量的增加，透光率呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，等高線圖雖為較明顯的橢圓形，但其等高線圖較疏松，表明爬坡較緩，顯著性不明顯。這表明交互項BC對透光率的影響不顯著。

2.2.3 澄清效果驗證性實驗（圖5）

圖4 因素交互作用對麥芽-麥胚芽酒澄清度影響的響應(yīng)曲面和等高線

通過Design-Expert V8.0.6 軟件所得到的回歸模型，預(yù)測的麥芽-麥胚芽酒澄清條件理論最佳值為：澄清時間6.75 h，澄清溫度46.39 ℃，纖維素酶添加量468.62 mg/L；預(yù)測最佳透光率為90.7374%，其可行性達(dá)到0.581。按照實際條件操作的可行性進(jìn)行模擬，選取實驗條件為澄清時間7 h，澄清溫度46.4 ℃，纖維素酶添加量470 mg/L 進(jìn)行驗證實驗，得到實際麥芽-麥胚芽酒的透光率為90.2 %，與理論預(yù)測值90.7374 %相差較小，可以采用。綜上所述，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化澄清工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，得到的工藝條件具有實際操作性。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素實驗選取最優(yōu)條件值，利用Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行Box-Benhnken 試驗設(shè)計，以澄清時間、澄清溫度、纖維素酶添加量為自變量，麥芽-麥胚芽酒的透光率為響應(yīng)值，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，所得自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程為：Y=89.22+1.74A+1.18B+3.31C-1.68AB+1.15AC+0.43BC-4.11A2-1.89B2-2.71C2，并確定麥芽-麥胚芽酒最佳澄清條件為：澄清時間7 h，澄清溫度46.4 ℃，纖維素酶添加量470 mg/L，得到酒體透光率為90.2%，為纖維素酶規(guī)模化用于酒類澄清及麥芽與麥胚芽工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

圖5 預(yù)測條件的可行性