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    茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的影響

    2021-03-05 04:36:44綦國(guó)紅張佳怡楊志萍陳貴堂
    食品工業(yè) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:茶多酚生物膜金黃色

    綦國(guó)紅,張佳怡,楊志萍,陳貴堂

    中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院(南京 211198)

    茶多酚(tea polyphenols,簡(jiǎn)稱(chēng)TP),是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng),主要化學(xué)成分為兒茶素類(lèi)(黃烷醇類(lèi))、黃酮及黃酮醇類(lèi)、花色苷類(lèi)、酚酸類(lèi)等。其中兒茶素類(lèi)化合物為茶多酚的主要成分,占茶多酚總量的65%~80%[1],是形成茶葉色香味的主要成分之一,也是茶葉保健功能的主要成分之一。

    茶多酚是一種廣譜的抗菌劑,其對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)以及其他腸道致病菌具有不同程度的抑制和殺傷作用。茶多酚通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合使得細(xì)胞膜的通透性增加,其內(nèi)容物、金屬離子和蛋白質(zhì)外泄,最終導(dǎo)致細(xì)菌代謝發(fā)生紊亂,從而產(chǎn)生直接的抗菌作用[2-3]。另外,茶多酚還能清除有害自由基,具有很強(qiáng)的抗氧化作用[4],因此茶多酚常用于食品防腐保鮮。

    金黃色葡萄球菌是人和動(dòng)物正常菌群的微生物,肉、蛋、奶及其制品常受此菌的污染[5]。并且它還能黏附在生物或非生物表面形成生物膜,來(lái)庇護(hù)該菌不受殺菌劑的作用。細(xì)菌生物膜的形成受許多因素影響,如細(xì)菌自身所處的環(huán)境因素會(huì)影響生物膜的產(chǎn)生[6-8]。試驗(yàn)研究不同環(huán)境條件下茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用,為茶多酚在生產(chǎn)上應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料、試劑

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),實(shí)驗(yàn)室保藏。茶多酚,合肥博美生物科技有限公司;結(jié)晶紫草酸銨染色液,永安化學(xué)實(shí)驗(yàn)室出品;胰蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;酵母提取物,Oxoid Ltd.;氯化鈉,西隴化工股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;ELxTM800多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)博騰儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

    測(cè)試菌充分活化后,按1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基,在37 ℃ 150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng),至菌體密度OD600nm達(dá)到0.3左右,分裝試管。按比例加入茶多酚水溶液,使茶多酚的終質(zhì)量濃度分別為2,4,6,8,10,12和14 mg/mL,約培養(yǎng)12 h,觀察各試管中菌的生長(zhǎng)情況,判定MIC。

    1.3.2 對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

    參照文獻(xiàn)[9],測(cè)試菌充分活化后,按照1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基,于37 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng),當(dāng)菌體OD600nm達(dá)到0.3左右時(shí),停止培養(yǎng)。將含有不同濃度的茶多酚溶液與菌液混合,使茶多酚終濃度分別為0.5,1和2MIC,加入錐形瓶中,將0.5 cm×0.5 cm的無(wú)菌輸液管片置于錐形瓶中,于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,棄掉培養(yǎng)液,添加新鮮的LB培養(yǎng)基和茶多酚,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出輸液管片,用無(wú)菌水沖洗表面浮菌,于45 ℃干燥30 min,用0.2%的結(jié)晶紫溶液染色3 min。用無(wú)菌水洗掉多余染色劑,于45 ℃干燥30 min,將處理好的輸液管片放入96孔板中,加入200 μL無(wú)水乙醇洗脫,取出輸液管片,用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處的吸光度。按照式(1)計(jì)算抑制率。

    1.3.3 茶多酚在不同NaCl濃度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    按1.3.2的方法,茶多酚終濃度為1MIC,NaCl終質(zhì)量濃度分別為20和30 mg/mL,并設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。

    1.3.4 茶多酚在不同pH條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    按1.3.2的方法,將菌液pH調(diào)為3,5,7,9和11,茶多酚終濃度為1MIC,進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.5 茶多酚在不同溫度條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    按1.3.2的方法,茶多酚終濃度分別為0.5,1和2MIC,分別于28和37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.6 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    按1.3.2的方法,分別在0,4,8,20和30 h加入茶多酚,使終濃度為1MIC,對(duì)照組為不加茶多酚,在37℃下靜置培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC

    根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果,8 mg/mL茶多酚是無(wú)菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度,因此判定茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為8 mg/mL。

    2.2 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

    由圖1可知,當(dāng)茶多酚濃度為0.5,1和2MIC時(shí),其對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的產(chǎn)生具有抑制作用。經(jīng)T檢驗(yàn),p<0.01,差異極顯著。生物膜的抑制率分別為49.8%,66.1%和67.8%,隨茶多酚濃度升高而增大。因此,茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生具有抑制作用。

    2.3 茶多酚在不同NaCl濃度條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    由圖2可知,金黃色葡萄球菌在高NaCl濃度下,生物膜形成量與空白組相比略下降但變化不大,經(jīng)T檢驗(yàn),加鹽試驗(yàn)組與空白組相比無(wú)差異(p>0.05)。添加茶多酚又添加NaCl的試驗(yàn)組與只加茶多酚組相比差異顯著(p<0.05),即加鹽后茶多酚組的生物膜形成量明顯減少。金黃色葡萄球菌為耐鹽菌,在高鹽濃度條件下能夠生長(zhǎng),但鹽的存在可以增強(qiáng)茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的抑制作用。

    圖1 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

    圖2 茶多酚在不同NaCl濃度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    2.4 茶多酚在不同pH條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    茶多酚水溶液在pH 2~7范圍內(nèi)較穩(wěn)定,抑菌作用效果明顯。由圖3可知,在pH 7~9范圍內(nèi),生物膜量較大,因?yàn)榇藯l件下茶多酚的抑菌效果較弱,也是金黃色葡萄球菌適宜生長(zhǎng)的pH。當(dāng)pH為5時(shí),生物膜產(chǎn)生量減少。當(dāng)pH為3時(shí),生物膜產(chǎn)生量急劇下降。因此,酸性條件加強(qiáng)了茶多酚的作用效果。但pH為11時(shí),茶多酚不穩(wěn)定,失去了抑菌作用。因此推測(cè)pH為11時(shí),生物膜產(chǎn)量急劇下降是因?yàn)閺?qiáng)堿對(duì)該菌的抑制作用所致。

    2.5 茶多酚在不同溫度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    經(jīng)T檢驗(yàn),當(dāng)茶多酚為1和2MIC時(shí),在37 ℃與28℃條件下,生物膜的形成量無(wú)明顯差異(p>0.05)。當(dāng)茶多酚為0.5MIC時(shí),在37 ℃與28 ℃條件下,生物膜的形成量有差異(0.01<p<0.05)。由此可見(jiàn),在37 ℃與28 ℃ 2種溫度條件下培養(yǎng),茶多酚對(duì)生物膜的形成量影響不大。但2種不同溫度條件對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響較大,37 ℃為最適生長(zhǎng)溫度,因此37℃下空白對(duì)照組的生物膜形成量明顯高于28 ℃下的空白組(圖4),且差異極顯著(p<0.01)。

    圖3 不同pH下茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    圖4 不同溫度下茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    2.6 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    經(jīng)T檢驗(yàn),在0和4 h添加茶多酚,形成的生物膜量與對(duì)照相比差異極顯著(p<0.01);8 h及以后添加茶多酚,形成的生物膜量與對(duì)照相比差異不顯著(p>0.05)(見(jiàn)圖5)。由此可知,加入茶多酚的時(shí)間越早,其對(duì)生物膜的抑制效果越好。隨著茶多酚加入時(shí)間的推遲,抑膜作用顯著減弱,培養(yǎng)20 h后再加茶多酚對(duì)生物膜的產(chǎn)生基本無(wú)抑制作用??赡苁遣瓒喾又饕獙?duì)早期生物膜的形成具有抑制作用,對(duì)已經(jīng)形成的成熟生物膜的破壞效果不大。

    圖5 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)旨在測(cè)定茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的定量抑制作用以及研究不同環(huán)境因素對(duì)茶多酚抑制生物膜效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)茶多酚濃度為0.5,1和2MIC時(shí),其對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成有明顯抑制作用,抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)。20 mg/mL和30 mg/mL NaCl以及酸性環(huán)境可以明顯增強(qiáng)茶多酚對(duì)生物膜的抑制效果;28 ℃與37 ℃培養(yǎng)對(duì)茶多酚的抑膜作用基本無(wú)影響;加入茶多酚時(shí)間越早,其對(duì)生物膜的抑制效果越好,培養(yǎng)20 h再加入茶多酚對(duì)生物膜幾乎無(wú)抑制作用。

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