超聲輔助有機(jī)溶劑法提取葡萄皮原花青素工藝條件

張玉清 ，畢可海 ，張玉瑩 ，李銀塔 ，王世蘋

1. 威海市特色果蔬高值加工工程技術(shù)研究中心（威海 264300）；2. 威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系（威海 264300）

原花青素是存在于植物中酚類化合物的總稱[1]，有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力[2]，其抗氧化和清除自由基的能力是維生素C的20倍。同時(shí)，因其安全無毒，被稱為目前最安全、最高效的天然抗氧化劑[3-6]。原花青素還具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗衰老、護(hù)肝解毒、防治糖尿病等功效，因此具有較高的食用、藥用價(jià)值，還可應(yīng)用于化妝品行業(yè)[7-11]。

原花青素在葡萄及松樹樹皮中含量較高[12-14]。葡萄是最常見的水果之一，美味可口、營養(yǎng)豐富，富含多種礦物質(zhì)及維生素[15]。葡萄的加工制品很多，如葡萄干、葡萄汁、紅酒等[16-19]，但是大部分都屬于初加工產(chǎn)物，而對于更深層次的，如原花青素的開發(fā)利用研究相對較少。

對葡萄中原花青素的提取研究主要集中在葡萄籽[20-23]，而從葡萄皮中提取原花青素的研究相對較少，且提取方法較為單一，主要有酶法提取[24]、有機(jī)溶劑提取法[10]等，提取效率較低。試驗(yàn)以有機(jī)溶劑法提取葡萄皮中的原花青素為基礎(chǔ)，以超聲輔助提取，并利用響應(yīng)面優(yōu)化提取條件，以提高原花青素提取量，并且反應(yīng)較為安全、高效，為拓展原花青素的提取條件研究、提高資源開發(fā)利用價(jià)值提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄（市售，山東榮成）；原花青素（上海阿拉丁生化科技）；乙醇、丙酮、甲醇、香草醛、硫酸等（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（普析通用）；電子天平（奧豪斯儀器（上海））；KQ-500DE超聲（昆山市超聲波儀器）；XW-80A旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器）。

1.3 試驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1 葡萄皮預(yù)處理

挑選好的葡萄除去枝干，清洗后剝皮、去肉、去籽，將葡萄皮置于烘箱中烘干，然后粉碎、過篩，制成葡萄皮粉末，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取原花青素標(biāo)品10 mg，用甲醇配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.025，0.050，0.100，0.200，0.250和0.500 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，分別取1 mL加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液和2.5mL 30%硫酸-甲醇溶液，搖勻，30 ℃水浴保溫20 min。在546 nm的波長下測其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 不同溶劑對葡萄皮中原花青素提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g葡萄皮粉末于錐形瓶中，分別向錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)均為50%甲醇、乙醇、丙酮溶液20 mL，將錐形瓶置于溫度60 ℃水浴鍋中水浴60min，經(jīng)過濾后提取2次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。取1 mL加入2.5 mL 3%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，搖勻，30 ℃水浴保溫20 min。在546 nm波長下測其吸光度。

1.3.4 溶劑體積分?jǐn)?shù)對葡萄皮中原花青素提取量的影響

按1.3.3所述方法，向錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%和70%乙醇溶液20 mL，探討乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取量的影響。

1.3.5 不同溫度對葡萄皮中原花青素提取量的影響

按1.3.3所述方法，將錐形瓶置于溫度分別為30，40，50，60，70和80 ℃的水浴鍋中水浴60 min，研究提取溫度對葡萄皮中原花青素提取量的影響。

1.3.6 不同提取時(shí)間對葡萄皮中原花青素提取量的影響

按1.3.3所述方法，將錐形瓶置于溫度50 ℃水浴鍋中分別水浴20，30，40，50，60和70 min，探討提取時(shí)間對原花青素提取量的影響。

1.3.7 料液比對葡萄皮中原花青素提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g葡萄皮粉末于錐形瓶中，按料液比分別為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40（g/mL），向錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，按1.3.3所述方法，研究料液比對原花青素提取量的影響。

1.3.8 提取次數(shù)對葡萄皮中原花青素提取量的影響

準(zhǔn)確稱取葡萄皮粉末于錐形瓶中，向錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，將錐形瓶置于溫度50 ℃水浴鍋中分別水浴40 min，過濾，分別提取1，2，3和4次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。按1.3.3所述方法，研究次數(shù)對原花青素提取量的影響。

1.3.9 超聲輔助對葡萄皮中原花青素提取量的影響

準(zhǔn)確稱取葡萄皮粉末于錐形瓶中，向錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，將錐形瓶置于35 kHz超聲中輔助提取，溫度50 ℃超聲40 min，取出，過濾，提取3次，合并提取液，旋蒸后用60%乙醇定容至25 mL。按1.3.3所述方法，探討超聲輔助提取對原花青素提取量的影響。

1.3.10 響應(yīng)面優(yōu)化

由單因素可知，料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素對原花青素的提取影響顯著，因此利用Central Composite Design（CCD）進(jìn)行響應(yīng)面分析探究各因素影響原花青素提取的規(guī)律，同時(shí)分析各因素間的關(guān)系，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，以料液比（g/mL）、提取時(shí)間（min）、提取溫度（℃）3個(gè)因素為研究對象，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。經(jīng)響應(yīng)面分析后得到原花青素的最大提取量和最優(yōu)提取條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.11 原花青素提取量的測定

原花青素提取量按式（1）計(jì)算[23]。

式中：V為試劑定容體積，mL；C為試劑中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；W為試劑質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以原花青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。原花青素質(zhì)量濃度在0.025～0.5 mg/mL內(nèi)線性良好，線性方程為y=1.518 3x+0.002 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 溶劑對葡萄皮中原花青素提取量的影響

原花青素能溶解于極性較強(qiáng)的溶劑中，因此選用50%甲醇、乙醇、丙酮溶液3種溶劑作為提取溶劑。由圖2可知，提取溶劑顯著影響原花青素提取量。其中，原花青素在乙醇溶劑中的提取量明顯高于另外2種溶劑，這可能是因?yàn)橐掖嫉娜芙庑暂^甲醇、丙酮要高，穿透細(xì)胞的能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的破壁效果，因而會(huì)有更多的原花青素溶出。因此，選用乙醇作為原花青素提取溶劑。這與鄭燕升等[25]的結(jié)果相似。

圖2 不同溶劑對原花青素提取量的影響

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對葡萄皮中原花青素提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著影響著原花青素提取。在一定范圍內(nèi)，隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)增加，原花青素提取量也隨之增大。溶劑溶度60%時(shí)，提取量達(dá)到最大，可達(dá)24.73 mg/g；繼續(xù)增大溶劑體積分?jǐn)?shù)，提取量反而降低。這可能是因?yàn)槠咸哑し勰┲泻械拇既苄噪s質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出，而這些成分也與乙醇-水分子結(jié)合，起到拮抗作用，因而原花青素的提取率下降[26]。因此，選擇最適乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取量的影響

2.4 提取溫度對葡萄皮中原花青素提取量的影響

提取溫度影響著原花青素的提取量。溫度低于50℃時(shí)，原花青素提取量隨著溫度升高而增大；50 ℃時(shí)達(dá)到最大；繼續(xù)升高溫度，原花青素提取量反而逐漸降低。這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溫度升高，可以促進(jìn)原花青素從細(xì)胞中溶出，而過高溫度可能會(huì)導(dǎo)致原花青素聚合，降低原花青素提取量，因此，選擇最佳提取溫度50 ℃。

圖4 不同溫度對原花青素提取量的影響

2.5 提取時(shí)間對葡萄皮中原花青素提取量的影響

由圖5可知，原花青素提取量受提取時(shí)間影響。在一定范圍內(nèi)，延長時(shí)間可以提高提取量。提取時(shí)間40 min時(shí)，提取量最大，為31.06 mg/g；而超過40 min后，原花青素提取量隨著時(shí)間延長而降低。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間延長，原花青素與空氣中的氧氣接觸而被氧化，降低原花青素提取量，因此，選擇最佳提取時(shí)間40 min。

圖5 提取時(shí)間對原花青素提取量的影響

2.6 料液比對葡萄皮中原花青素提取量的影響

料液比顯著影響著原花青素提取量。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，料液比增大，提取量也隨之增大，料液比1∶25（g/mL）時(shí)提取量達(dá)到最大，繼續(xù)增大料液比，原花青素提取量逐漸降低，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑可使原花青素與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合的氫鍵斷裂[27]，提高原花青素提取量，而過多有機(jī)溶劑可能會(huì)影響原花青素后期的純化不利，因此，選擇最適料液比1∶25（g/mL）。

圖6 料液比對原花青素提取量的影響

2.7 提取次數(shù)對葡萄皮中原花青素提取量的影響

由圖7可知，重復(fù)提取，可以增大原花青素提取量，提取2次時(shí)葡萄皮中大部分花青素已被提取出，提取3次時(shí)原花青素基本提取完全，提取次數(shù)超過3次后，提取量增加幅度極小，為避免造成浪費(fèi)，選擇最佳提取次數(shù)3次。

圖7 提取次數(shù)對原花青素提取量的影響

2.8 超聲輔助對葡萄皮中原花青素提取量的影響

由圖8可知，超聲輔助可以提高原花青素提取量，相較于未使用超聲輔助提取量可提高11.73%，這可能是因?yàn)?，超聲輔助可使葡萄皮細(xì)胞的裂解更充分，原花青素的溶出更充分，從而增大提取量。這與張曉娟等[1]結(jié)果相似。

圖8 超聲輔助對原花青素提取量的影響

2.9 響應(yīng)面分析

2.9.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

經(jīng)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原花青素提取量受提取溫度、提取時(shí)間及料液比的影響較大，為探究3個(gè)因素對原花青素提取規(guī)律，以響應(yīng)面試驗(yàn)分析，通過數(shù)據(jù)處理，建立響應(yīng)值（提取量）與3個(gè)因素間的回歸模型，得到的回歸方程：Y=38.13+4.83A+1.48B+0.67C-1.05AB+0.49AC-0.49BC-4.38A2-0.93B2-1.44C2（其中，Y，原花青素提取量；A，提取溫度；B，提取時(shí)間；C，料液比）。

表2 三因素三水平RSM試驗(yàn)及原花青素提取量

通過響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3。模型的p＜0.000 1，顯著，而失擬值p＞0.05，不顯著，表明模型有著較高的可靠性，同時(shí)模型上的數(shù)據(jù)被充分?jǐn)M合；原花青素提取量的變異系數(shù)CV=0.47，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3，說明預(yù)測結(jié)果可靠，模型相關(guān)度較好，誤差?。徊⒄f明方程能較好地描述響應(yīng)值與各因素間關(guān)系，可用于預(yù)測實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果。

2.9.2 響應(yīng)面的交互作用分析

通過響應(yīng)面曲線圖可以分析出提取溫度、時(shí)間、料液比3因素對原花青素提取量的影響，可以直觀地觀察各因素間的交互作用以及確定原花青素最大提取量和最適提取條件。

表3 RSM變量方差分析

圖9可以反映出在提取溫度一定條件下，提取時(shí)間和料液比均會(huì)顯著影響原花青素的提取，在一定范圍內(nèi)，原花青素提取量隨著提取時(shí)間的延長及料液比增大而增大，并且兩者交互作用顯著影響提取量。在提取時(shí)間一定條件下，提取溫度和料液比對原花青素的提取影響較大，從等高線圖可知，提取溫度對原花青素的提取影響更大。在料液比一定條件下，提取溫度、時(shí)間顯著影響原花青素的提取，隨著溫度升高和時(shí)間延長，提取量逐漸增大，并且兩者交互影響顯著。

在影響原花青素提取量的因素中，提取溫度對原花青素提取量的影響最為顯著，提取時(shí)間次之。

2.9.3 回歸模型驗(yàn)證

圖9 原花青素提取量的響應(yīng)面圖

通過模型分析及原花青素最優(yōu)提取條件的預(yù)測，得出在提取溫度55 ℃、提取時(shí)間44 min、料液比1∶26（g/mL）時(shí)，原花青素提取量預(yù)測值為39.78 mg/g。對最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證（見表4），選擇提取溫度55 ℃、提取時(shí)間44 min、料液比1∶26（g/mL）、平行3次。結(jié)果表明，驗(yàn)證值與模型的預(yù)測值的誤差相對較小，說明該模型可對提取量進(jìn)行分析預(yù)測。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以超聲輔助有機(jī)溶劑提取法提取葡萄皮中原花青素，通過優(yōu)化不同提取條件，如不同提取溶劑、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等條件。初步確定葡萄皮中原花青素的提取條件：提取溶劑采用60%乙醇，溫度50 ℃，提取時(shí)間40 min，料液比1∶25（g/mL），在超聲輔助下提取3次，原花青素提取量可達(dá)38.47 mg/g。通過響應(yīng)面優(yōu)化分析，在提取溫度55 ℃、提取時(shí)間44 min、料液比1∶26（g/mL）條件下，原花青素提取量可達(dá)39.42 mg/g。結(jié)果表明葡萄皮中富含原花青素，通過超聲輔助有機(jī)溶劑提取，可有效提取原花青素，且提取過程安全、無毒。試驗(yàn)結(jié)果為原花青素的提取及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。