表面增強拉曼光譜技術在外泌體檢測中的研究進展

林慧晶，吳 瓊，陳冠楠，陳 榮，林 多

（醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建省光子技術重點實驗室，福建師范大學，福州 350007）

外泌體是胞內(nèi)體與細胞膜融合后釋放到細胞外的脂質雙層囊泡，直徑大約在30～150 nm，廣泛分布于血液、尿液、唾液、羊水、母乳和腹水等體液中。外泌體最早是Johnstone等［1］在研究網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程中發(fā)現(xiàn)的。外泌體最初被認為只是細胞的“垃圾袋”，用于清除不必要的成分，這導致與其相關的研究沉寂了二十多年。直到2007年，Valadi等［2］首次報道外泌體也含有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并對其組成和功能進行了深入的研究，使得外泌體成為生命科學研究領域的熱點?，F(xiàn)如今我們知道，外泌體攜帶著其來源細胞的各種分子成分，包括蛋白質、脂質、信使RNA（mRNA）和非蛋白質編碼小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）等（圖1），可以在細胞間轉移，因此被視為細胞間通信的一種重要模式［3］。越來越多的證據(jù)表明，癌癥衍生的外泌體可以轉移致癌活性并調節(jié)血管生成、免疫和轉移，以促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［4-9］。外泌體作為細胞間信息傳遞的載體，存在于各種體液中，尤其是在疾病標志物篩選中起了重要的作用［10-11］。因此，外泌體是一種極具潛力的非侵入性癌癥篩查、癌癥進展評估和治療反應監(jiān)測的生物標志物。

圖1 外泌體結構示意圖Fig. 1 Structure of exosomes

目前，外泌體的檢測技術［12-14］主要包括：透射電鏡、蛋白質免疫印跡技術（Western blot， WB）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術、流式細胞術、納米顆粒跟蹤分析技術、動態(tài)光散射技術以及基因測序技術。這些分析技術極大地推動了外泌體的研究進程，但也存在著一些局限：ELISA需要大量高度濃縮的樣品，無法實現(xiàn)復雜樣本的快速分析［15］；納米顆粒跟蹤分析技術對外泌體濃度的測量范圍有限（每毫升只有106到109個）［16-17］；流式細胞術分析外泌體可能存在回收信號弱等問題［18］；透射電鏡檢測、PCR與TamSeq二代測序技術則存在檢測費用昂貴、操作步驟復雜、耗時等不足?？傊?，目前外泌體分析檢測仍然沒有“金標準”，因此，急需進一步發(fā)展外泌體檢測新方法，加快癌癥體液活檢的發(fā)展進程。

拉曼光譜是一種基于非彈性散射的分子光譜技術，能夠識別蛋白質、核酸、脂肪等生化物質分子［19］。但在實際應用中，目標分子固有的拉曼散射截面極小，并且目標樣品的熒光信號強，常常造成常規(guī)拉曼信號微弱，被淹沒在熒光信號中［20］。直到1974年，F(xiàn)leischmann等［21］科學家發(fā)現(xiàn)，表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）可以將吸附在粗糙金屬表面的待測物拉曼信號增強103～1015倍，實現(xiàn)單分子檢測，同時還能淬滅生物樣品的自體熒光信號，極大地增強了拉曼光譜的信號。目前，科學界對SERS的增強機理還未給出一個清晰統(tǒng)一的解釋，普遍認為SERS效應是由物理增強與化學增強共同作用的結果［22-23］。物理增強主要是電磁場增強，分析物吸附或靠近粗糙的貴金屬表面時，受金屬表面等離子體共振導致局域電磁場增強。化學增強由電荷轉移引起，分析物吸附或足夠靠近金屬表面，通過電荷轉移產(chǎn)生增強現(xiàn)象。盡管SERS的增強機理復雜尚需進一步探索，但是SERS技術已廣泛應用于多個領域，這歸功于SERS技術在生物樣品檢測方面具有的獨特優(yōu)勢：1）超高靈敏度，實現(xiàn)待測物的痕量分析；2）不受水溶液信號的干擾，可檢測液體狀態(tài)下的樣品；3）有效淬滅生物樣品自體熒光，獲取高質量拉曼光譜。SERS技術廣泛應用于生物醫(yī)學的各個領域［24］，如核酸、蛋白質、人體細胞、人體組織以及人體體液的檢測。

近年來，人們開始嘗試將超高靈敏度的SERS技術用于外泌體的檢測，試圖發(fā)展一種高效、無損的液體活檢新技術［25］。基于SERS技術的外泌體檢測策略可分為兩種：一種是無需引入拉曼探針的非標記SERS技術，直接獲得外泌體自身的拉曼信號，該方法的優(yōu)勢是簡單快速，可以更直接分析外泌體的成分，但各類生物分子的信號有可能互相重疊，造成部分診斷信號的丟失；另一種是標記SERS技術，利用拉曼探針分子對外泌體進行標記，通過檢測標記分子的拉曼強度，間接檢測外泌體的存在以及濃度，該方法常常有著更高的檢測靈敏度和特異性。本文主要介紹SERS在外泌體中的非標記和標記檢測的發(fā)展進程，并且展望了SERS在外泌體中的應用前景。

1 SERS技術對外泌體的非標記檢測

非標記檢測是將純化后的外泌體直接吸附或非?？拷黃ERS基底表面獲取外泌體的拉曼光譜信號。為了獲取理想的外泌體拉曼信號，需要制備高效的SERS增強基底。

2012年，Tirinato等［26］利用光刻技術刻蝕規(guī)則六角形圖案形成超疏水表面，用于檢測從正常結腸細胞和結腸癌細胞分離出來的外泌體。超疏水表面可有效聚集液滴，與光學共振現(xiàn)象相結合，增強了SERS光譜信號。結果表明，從正常細胞中提取的外泌體呈現(xiàn)出與脂質振動相對應的較高的峰值強度，而從腫瘤細胞系中提取的外泌體則表現(xiàn)出較豐富的RNA含量。超疏水表面將外泌體濃縮到基底的活性區(qū)域，方便了SERS對生物樣品進行極精確的分析和表征。2015年，Lee等［27］利用濺射技術在3D納米碗表面涂覆一層銀膜作為SERS基底，用于檢測卵巢癌細胞的外泌體隨時間推移的SERS信號。這一3D納米碗用于檢測外泌體具有獨特的優(yōu)勢：首先，與還原法制備的銀納米粒子相比，濺射等離子體表面具有更低的SERS背景信號；其次，外泌體在早期保持完整的形態(tài)，通過SERS可檢測外泌體膜表面的蛋白與脂質，隨著碗內(nèi)的水分蒸發(fā)至干涸，外泌體破裂時，可檢測到外泌體內(nèi)容物的SERS光譜。2017年，該小組繼續(xù)開展相關研究［28］，利用表面修飾巰基肽配體的銀納米顆粒對具有α3?1高表達的卵巢癌外泌體進行特異性捕獲。隨著靶向特異性配體庫的發(fā)展，該方法可以從富含外泌體的體液中選擇性地發(fā)現(xiàn)和分析目標外泌體，是一項在早期疾病檢測方面極具潛力的技術。2017年，Sivashanmugan等［29］將銀納米立方體組裝在金納米棒陣列表面熱環(huán)直徑上形成等離子間隙模式SERS陣列底物來研究外泌體。他們利用所開發(fā)的SERS基底，研究了正常肺細胞和癌細胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體的較強SERS信號主要是來源于蛋白質，而正常外泌體的SERS信號主要來源于蛋白質、脂質和核酸等生物分子。同年，Miquel等［30］發(fā)現(xiàn)在常規(guī)記錄盤（CD-R和DVD-R）上涂覆薄銀層后可以顯著增強拉曼光譜信號，這主要與聚碳酸酯結構、銀厚度和激發(fā)波長有關。他們在經(jīng)過試驗后獲得了無標記的血紅蛋白和外泌體的SERS光譜，這表明了該方法的生物傳感潛力。該方法的最大優(yōu)勢是SERS基底制備簡單、費用低并且易于大規(guī)模制備。

以上介紹的外泌體SERS檢測平臺均是基于銀納米顆粒。而金納米粒子相對于銀納米粒子具有更好的生物相容性，基于金納米顆粒的外泌體SERS檢測在近年來也得到了顯著的發(fā)展。2014年，Laura等［31］應用SERS技術初步研究了卵巢癌細胞在正常氧氣條件下和缺氧條件下的外泌體組成分差異。2016年，Stremersch等［32］制備了一種帶正電荷的金納米粒子，由于靜電吸附會使得金納米粒子與囊泡（囊泡包括外泌體）吸附在一起，增強拉曼信號。他們利用偏最小二乘法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）與多元曲線分辨率交替最小二乘法（multivariate curve resolution alternating least squares，MCR-ALS）分析算法分析得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)，能夠區(qū)分來自正常細胞和癌細胞的囊泡。2017年，Park等［33］將SERS技術和統(tǒng)計算法相結合，發(fā)展了一種無標記、高靈敏度的外泌體分類方法。此次試驗以金納米粒子為SERS增強基底，采用主成分分析方法分別對肺癌細胞與正常細胞分泌的外泌體的光譜進行分析，判別靈敏度為95.3%，特異性為97.3%。2018年，Carmicheal等［34］利用非標記SERS技術聯(lián)合主成分微分函數(shù)分析（principal component differential function analysis，PCDFA）算法對來源于胰腺癌和正常胰腺上皮細胞分泌的外泌體進行區(qū)分，判別準確率可達90%。他們進一步將這種方法應用于血清中外泌體的檢測分析，同樣獲得了理想的效果，有望發(fā)展一種胰腺癌早期檢測新方法。想要利用非標記SERS檢測技術達到分辨外泌體的目的，除了需要制備具有顯著增強效果的SERS基底之外，還需要發(fā)展更高效的數(shù)據(jù)處理方法。2020年，Shin等［35］利用計算機深度學習對來自正常細胞系和肺癌細胞系的外泌體的SERS信號進行了訓練，并提取兩類外泌體光譜的特征后建模用于分析和預測人血漿來源外泌體的SERS光譜。該試驗將外泌體的SERS光譜分析與深度學習相結合，成功地鑒定了肺癌患者，甚至發(fā)現(xiàn)了處于第一階段的病人。該方法無創(chuàng)、安全、靈敏，對肺癌早期液體活檢方法的發(fā)展具有重要意義。

非標記SERS技術展示了外泌體自身的“指紋”圖譜后，再利用多元統(tǒng)計及計算機深度學習算法對其深入挖掘診斷信息并建立判別模型，最終實現(xiàn)區(qū)分和追溯不同來源的外泌體。當前，非標記SERS外泌體檢測技術向臨床轉化的過程中面臨重重困難，但是我們相信隨著外泌體研究樣本的數(shù)量的擴大和相關技術的發(fā)展，該方法極有可能被廣泛用于臨床檢測中。

2 SERS技術對外泌體的標記檢測

SERS標記檢測是一種將SERS光譜技術與抗體抗原特異作用相結合的納米標記免疫分析技術。SERS納米標記是一類含有強烈拉曼信號的等離子體納米粒子。通過類似抗體抗原的特異反應作用使得SERS納米標記與目標外泌體相結合形成“三明治”復合物，再通過檢測此復合物的拉曼標記分子的拉曼強度，間接表征目標分子的分布和濃度。常見的“三明治”結構主要可以分為兩類：一類是“拉曼探針-外泌體-磁珠”（圖2），另一類是“拉曼探針-外泌體-芯片”（圖3）。

圖2 “拉曼探針-外泌體-磁珠”結構類型示意圖［36］Fig. 2 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-magnetic beads”［36］

2.1 “拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測模型

通常，與正常細胞相比，腫瘤細胞會分泌更多的外泌體，并且其膜表面有特殊的生物標記物（主要是一些跨膜蛋白），這使得腫瘤源性外泌體成為一種重要的癌癥生物標記物。因此，研究人員就利用腫瘤源性外泌體含有多種特異性蛋白的特點，設計了一系列“拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測模型。如圖2所示，該方法通常使用兩種納米顆?！判约{米珠和SERS納米探針，且在兩種粒子表面修飾有兩種特異性抗體，可以單獨識別外泌體上的兩種不同的蛋白質。在靶向外泌體的存在下，SERS納米探針、外泌體和磁性納米粒子之間形成了“三明治”型免疫復合物。在有磁鐵的情況下，免疫復合物可以沉淀，因此SERS納米探針將在沉淀中檢測到SERS信號。而在沒有靶向外泌體的情況下，由于不能形成免疫復合物，沉淀只有磁性納米顆粒，SERS信號幾乎檢測不到。這樣，SERS信號可以用來判別目標外泌體的存在。近年來，越來越多的人發(fā)現(xiàn)標記SERS在外泌體研究中的應用潛力，其中“拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測模型引起了一大部分人的興趣。

圖3 “拉曼探針-外泌體-芯片”結構類型示意圖［43］Fig. 3 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-chip”［43］

2016年，Zong等［36］提出了利用磁性納米粒子和核-殼結構納米探針來識別和捕獲靶外泌體，形成“三明治”型免疫復合物，實現(xiàn)對靶外泌體的定性和定量檢測，其檢測極限比其他大多數(shù)報道的方法都要低。其中，磁性納米粒子是先在Fe3O4納米粒子表面包覆一層二氧化硅，然后在二氧化硅表面附著抗體制備而成的。拉曼探針是以銀包金納米棒（gold core-silver shell nanorods，Au@Ag NRS）為激發(fā)核，然后修飾上染料分子作為拉曼報道分子，再包裹上硅層，最后在硅層表面修飾抗體。該方法可以直接從細胞培養(yǎng)基中檢測出外泌體，無需其他復雜的操作，且檢測極限低于其他報道的方法。因此，與現(xiàn)有外泌體檢測方法對比，SERS的檢測方法簡單、省時，是一種分析和檢測腫瘤外泌體的有效方法。2017年，該課題組又提出了一種同時多重檢測外泌體的方法［37］。為了識別三種不同癌細胞分泌的外泌體，在金納米粒子表面修飾三種對應的適配體及拉曼報道分子制備成捕獲探針。上清液中存在有三種探針，當一種目標外泌體被加入，就會與相應的磁珠和探針特異性吸附，復合物在磁鐵作用下被聚集到管子底部。這時，上清液中這種外泌體的捕獲探針明顯減少，對應的這種探針的拉曼峰明顯減弱。為了驗證該方法的實用性，試驗最后采用從乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的患者體內(nèi)獲得的真實血液樣品進行檢測。2018年，Tian等［38］再次證明“拉曼探針-外泌體-磁珠”結構類型的SERS生物傳感器具有相當大的潛力，可以作為便捷和高靈敏度的量化工具，以檢測生物樣品中的外泌體。2019年，Zhan等［39］基于帶負電的DNA四面體和帶正電的Au NPs之間靜電吸引的原理，開發(fā)出一種將金納米粒子組裝在四面體上的新型拉曼探針（assembling gold nanoparticles in triangular pyramid DNA，TP-Au NPs）。這種帶有強電磁熱點的傳感器可極大增強SERS信號。人乳腺癌細胞MCF-7外泌體上的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）含量很高，因此在檢測外泌體時，可選擇EpCAM適配體和膽固醇修飾的DNA用于識別和富集外泌體。首先，鏈霉親和素修飾的磁珠與生物素修飾的EpCAM適配體反應，捕獲富集外泌體。其次，膽固醇修飾的DNA與TP-Au NPs SERS探針雜交，并且SERS探針上附著的膽固醇與外泌體脂質膜之間的疏水相互作用進而識別外泌體，形成類似“三明治”結構。該方法可以有效區(qū)分從健康個體和乳腺癌患者血漿中提取的外泌體。循環(huán)外泌體PD-L1可作為預測抗PD-1/PD-L1的臨床療效指標。2020年，Pang等［40］提出了一種可以直接從血清中捕獲和分析PD-L1外泌體的方法。首先，由于TiO2殼能與外泌體上磷脂分子的親水性磷酸“頭部”結合，因此可以利用Fe3O4@TiO2納米顆粒來富集外泌體。其次，加入PD-L1抗體修飾的Au@Ag@MBA-SERS標記探針，對PD-L1外泌體進行定量標記。根據(jù)該方法，僅需使用4μL臨床血清樣品即可精確定量外泌體PD-L1，整個過程可在40 min內(nèi)完成。

鑒于miRNA在基因表達轉錄后的調控中起到至關重要的作用，miRNA已被視為癌癥檢測的潛在生物標志物。外泌體脂質雙層的性質可以避免miRNA降解，使得外泌體中的特異性miRNA非常適合作為癌癥早期診斷和預后的生物標志物。一般標記SERS技術檢測外泌體核酸的模型類似“三明治”結構，miRNA鏈連接在探針與磁珠間，但是由于此時磁珠體積明顯比探針大，磁珠外表面均可以連接核酸與探針，因此形成了核衛(wèi)星結構。2018年，Ma等［41］發(fā)展了一種基于雙鏈特異性核酸酶輔助循環(huán)放大的SERS方法，用于定量檢測人血液中外泌體的miRNA。2019年，Pang等［42］再一次驗證了雙鏈特異性核酸酶輔助循環(huán)放大的SERS生物傳感器的可行性。該試驗方法在核酸酶輔助下進一步放大信號，可以實現(xiàn)單堿基識別的檢測限，并且不需要多次洗滌和雜交，適合于臨床診斷。

2.2 “拉曼探針-外泌體-芯片”SERS檢測模型

標記SERS在外泌體的定性與定量研究中極具潛力。試驗中，外泌體的分離與富集方法除了考慮如上述一樣使用磁珠之外，還可以考慮使用SERS芯片。利用外泌體上的兩種不同的蛋白質，然后在基板和探針上分別修飾兩種特異性抗體，在靶向外泌體的存在下，可以在探針、外泌體和芯片之間形成類似“三明治”型免疫復合物，然后沖洗多余非靶向外泌體后即可進行SERS檢測（圖3）。我們發(fā)現(xiàn)越來越多的“拉曼探針-外泌體-芯片”這類SERS檢測模型被提出并設計成相關試驗。

2018年，Li等［43］開發(fā)了一種包被抗體的多巴胺芯片和SERS探針。該檢測芯片及拉曼探針實現(xiàn)了對胰腺癌衍生外泌體的超靈敏和特異檢測，可在2 mL樣品溶液實現(xiàn)單個外泌體的檢測，并且只需通過2 mL的血清樣本的分析即可區(qū)分胰腺癌患者和健康人群。該方法有望用于胰腺癌的早期診斷、分類和轉移監(jiān)測等方面。同年，Kwizera等［44］將一個模板陣列固定在標準鍍金玻璃鏡片上，然后在陣列孔板上修飾抗體制備成一種小型化親和基裝置用于外泌體的捕獲。金納米棒通過十六烷基三甲基溴化銨與外泌體上的脂質膜之間的靜電作用與外泌體相結合，可實現(xiàn)乳腺癌細胞培養(yǎng)基和人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌患者來源的外泌體上幾種表面蛋白標志物的定量檢測。HER2陽性乳腺癌患者血漿中的外泌體比健康供體中的HER2和EpCAM的水平更顯著（P≤0.01），表明HER2和EpCAM這些標志物在乳腺癌診斷中的診斷潛力。該試驗將加速外泌體的研究，并為新型癌癥液體活檢的實現(xiàn)奠定基石。由于外泌體miRNA表達水平與癌癥之間存在密切的關聯(lián)，因此Lee等［45］開發(fā)了基于SERS的傳感平臺，用于定量測定外泌體miRNA。首先在均勻的金納米柱基板上修飾捕獲探針，當目標外泌體miRNA出現(xiàn)時就會被探針序列捕獲，由于目標外泌體miRNA序列較長，還有部分序列裸露在外，因此再加入帶有拉曼報道分子的序列與裸露的序列進行互補連接，即可在基底上同時鎖定目標外泌體的miRNA及拉曼探針。該傳感器可以可靠地觀察乳腺癌細胞系中的外泌體miRNA表達模式，并可以基于這些模式之間的差異來區(qū)分乳腺癌亞型。結果表明，該傳感器可定量測量體液中外泌體miRNA，有望用于普遍的癌癥診斷和進一步的生物醫(yī)學應用。

3 總結與展望

外泌體廣泛存在于人體各種體液中，在細胞間信息傳遞系統(tǒng)中扮演重要角色，是一種新興的液體活檢標志物。然而當前有關外泌體的研究尚處于初級階段，存在檢測靈敏度低、檢測步驟繁瑣、成本費用高等問題。近年來，SERS技術被應用于外泌體的檢測研究，極大地提高了外泌體檢測的靈敏度，這對于基于外泌體的液體活檢新技術的發(fā)展意義重大。SERS技術檢測外泌體的形式主要分為非標記檢測與標記檢測。非標記檢測可獲得外泌體自身的整體生化信息，并且檢測簡便、快捷、成本低；而標記檢測則提高了對外泌體識別的特異性，還能夠同時識別并檢測多種癌細胞系分泌外泌體。雖然目前SERS技術在外泌體檢測方面已經(jīng)取得一定的進展，但是深入研究依然面臨許多挑戰(zhàn)，例如：1）繼續(xù)探索高效的SERS檢測基底，進一步提高外泌體的拉曼信號，提升檢測極限；2）繼續(xù)發(fā)展適用于外泌體表面蛋白和內(nèi)部核酸物質的SERS檢測策略，獲得高質量且重復性好的拉曼信號，提取全面的診斷信息；3）發(fā)展高效的機器學習算法，對外泌體的SERS信號進行深度挖掘，實現(xiàn)對不同來源外泌體的快速、準確識別；4）對外泌體進行功能化的改造，并結合SERS技術對外泌體的生物學行為進行表征；5）繼續(xù)擴大臨床檢測樣本，進一步驗證基于SERS的外泌體檢測技術的可行性和適用性。隨著相關技術的進一步發(fā)展，我們相信基于SERS技術的外泌體檢測技術有望成為一種無損、便捷、準確的液體活檢新方法。