高效液相法測(cè)定南方紅豆杉中金松雙黃酮的含量*

林 芳，包 敏，吳澤君，肖人鐘，胡冠羽，易 穎，凌子懿，黃 昕

(1 株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000；2 湖南天大生物科技股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410136)

南方紅豆杉是紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)ChengetL.K.Fu栽培品的干燥枝條。在我國(guó)用藥歷史悠久，具有消腫散結(jié)、通經(jīng)利尿的功效，臨床上用于治療癥瘕積聚，風(fēng)濕痹痛，水腫，小便不利。歷史悠久，具有消腫散結(jié)、通經(jīng)利尿的功效，臨床上用于治療癥瘕積聚，風(fēng)濕痹痛，水腫，小便不利。

化學(xué)成分研究表明，南方紅豆杉中有效成分主要為紫杉烷類、黃酮類、多糖類[1-3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)南方紅豆杉的研究主要集中在以紫杉醇為代表的紫杉烷類，而發(fā)揮南方紅豆杉藥材紫杉烷類、黃酮類、多糖類、酚類等多種活性成分的綜合功效，開(kāi)展中醫(yī)藥臨床推廣應(yīng)用，有效部位或活性成分提取、中藥新制劑研究等將成為今后的發(fā)展方向。南方紅豆杉中的黃酮類化合物含量高，且是一類具有獨(dú)特藥理活性的天然產(chǎn)物，具有降脂、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化等作用。藥理研究發(fā)現(xiàn)，金松雙黃酮具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、提高紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率的作用[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相法測(cè)定金松雙黃酮含量的方法。并對(duì)湖南、浙江、江西、福建不同產(chǎn)地的11批南方紅豆杉金松雙黃酮的含量進(jìn)行了考察，為全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：Ultimate3000高效液相色譜儀、Chromeleon7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，賽默飛有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XSE205DU電子分析天平，梅特勒托利多有限公司。

藥材：南方紅豆杉藥材共11批，經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所吳澤君教授鑒定為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)ChengetL.Fu的帶葉枝條。

試劑：金松雙黃酮，購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司(批號(hào): PRF9110541,純度：98% )；乙腈(色譜純)，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用AcclaimTM120 C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)柱，流動(dòng)相：乙腈-0.2%冰醋酸(70:30)，流速:1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金松雙黃酮對(duì)照品18.760 mg至50 mL量瓶中，加入少量DMSO溶解，再加甲醇定容至刻度，配制成濃度為442 μg·mL-1金松雙黃酮對(duì)照品母液，并用甲醇逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.3 供試品溶液及空白溶液的制備

取藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇-丙酮(3:1)25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇-丙酮(3:1)補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。不加供試品，同法操作，即得空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，分別以對(duì)照品量C(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.7609x+0.0153，線性范圍為：0.3677～183.85 μg·mL-1，r=0.9999，表明金松雙黃酮在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 檢出限及定量限

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比(S/N)為3所對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，信噪比(S/N)為10所對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。結(jié)果金松雙黃酮的檢出限為0.01 μg·mL-1，定量限為 0.02 μg·mL-1。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是金松雙黃酮峰面積的RSD分別為:2.1%,顯示精密度良好(n=6)。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，12，24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是金松雙黃酮的面積的RSD分別為:0.8%,表明金松雙黃酮在24 h內(nèi)穩(wěn)定(n=6)。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一南方紅豆杉樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是金松雙黃酮的面積的RSD分別為:2.6%，表明本方法具有較好的重復(fù)性(n=6)。

2.4.6 加樣回收率

取南方紅豆杉樣品0.1 g，精密稱定，共9份，分別加入適量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下制備成供試品溶液，進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果為金松雙黃酮的平均回收率為101.6%，RSD為4.5%。

2.5 樣品測(cè)定

取11批樣品，按照“2.3”項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 南方紅豆杉HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Taxus chinensis var. mairei

表1 南方紅豆杉中金松雙黃酮的含量Table 1 Contents of sciadopitysin in Taxus chinensis var. mairei

3 討 論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、丙酮、甲醇:水(8:2)、乙醇、乙醇:水(8:2)、甲醇:丙酮(1:1)、甲醇:丙酮(3:1)4種提取溶劑，結(jié)果以甲醇:丙酮(3:1)提取的效率高，考察了超聲、回流2種提取方法，兩種方法沒(méi)有顯著性差異，故選擇簡(jiǎn)單操作的超聲處理，以甲醇:丙酮(3:1)為提取溶劑。

3.2 樣品測(cè)定

不同產(chǎn)地南方紅豆杉中金松黃酮成分的含量呈現(xiàn)一定的差異，最高為0.65%，最低為0.42%，可能與不同地域、不同采收時(shí)間有關(guān)，本項(xiàng)目將進(jìn)一步研究。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于南方紅豆杉中金松雙黃酮成分的測(cè)定。