堿脅迫對(duì)唐古特白刺生長(zhǎng)及葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

張慧芳，閆海冰，馮 帆，于兆友，楊秀清

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，030801，山西太谷)

土壤鹽堿化已成為一個(gè)全球性的資源和環(huán)境問題，這一生態(tài)災(zāi)難嚴(yán)重制約農(nóng)作物生長(zhǎng)和林草等植被生存，打破了生態(tài)平衡及其系統(tǒng)穩(wěn)定[1]。鹽堿化土壤對(duì)植物造成的脅迫既含有以NaCl和Na2SO4等中性鹽為主的鹽脅迫，也包括以NaHCO3和Na2CO3等堿性鹽為主的堿脅迫[2]。堿脅迫對(duì)植物形成除與鹽脅迫共有的離子毒害和滲透脅迫外，還有高pH值脅迫[3]。堿脅迫造成的pH值增高嚴(yán)重影響植物根部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜透性，導(dǎo)致根系活力降低，甚至影響植物葉片的結(jié)構(gòu)和生理功能[3]，從而產(chǎn)生比鹽脅迫更強(qiáng)的生態(tài)破壞力。

唐古特白刺(Nitrariatangutorum)，一種生態(tài)抗逆兼果肉經(jīng)濟(jì)型灌木，具有抗風(fēng)沙、耐鹽堿、耐貧瘠等生態(tài)適應(yīng)性，廣泛分布于寧夏、內(nèi)蒙古、新疆等地區(qū)，在保持水土、改良鹽堿地及防風(fēng)固沙等方面發(fā)揮著積極作用[4]。目前關(guān)于唐古特白刺的耐鹽性研究多集中在鹽脅迫，而對(duì)堿脅迫涉及相對(duì)較少。筆者擬采用不同濃度的NaHCO3和Na2CO3混合溶液對(duì)唐古特白刺進(jìn)行堿脅迫處理，研究不同濃度堿脅迫下唐古特白刺的生長(zhǎng)、生理響應(yīng)及葉片超微結(jié)構(gòu)的變化，探討唐古特白刺的耐堿能力及耐堿機(jī)制，以期為實(shí)現(xiàn)唐古特白刺在抑制鹽堿地土壤退化和實(shí)現(xiàn)鹽堿化土壤的持續(xù)生物改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子采集及幼苗培養(yǎng)

試驗(yàn)所用唐古特白刺種子取自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣的白刺產(chǎn)地(海拔1 036 m，E 106°28′，N 40°32′)。挑選大小一致、顆粒飽滿的種子于0.05% KMnO4溶液避光浸泡12 h，蒸餾水沖洗干凈備用。

采用純沙進(jìn)行幼苗培養(yǎng)。將0.5% KMnO4溶液殺菌后的純沙置于16 cm×14 cm營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽播白刺種子20粒，共20缽，種植深度約4 cm，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為平均溫度26 ℃，光照時(shí)間14 h，光照強(qiáng)度1 200 Lux，每3天澆灌蒸餾水100 mL，沙子濕度約為飽和含水量的60%。

1.2 堿脅迫處理

堿溶液配置：NaHCO3和Na2CO3按摩爾比1∶1混合溶解于蒸餾水，設(shè)置4個(gè)濃度梯度：200、300、400、500 mmol/L。待實(shí)生苗長(zhǎng)出6～8片真葉時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)健壯、均勻一致的幼苗15缽，每缽6株，每個(gè)濃度處理幼苗3缽，每隔3 d澆灌不同濃度的堿溶液100 mL，對(duì)照組為蒸餾水100 mL，澆灌后及時(shí)將托盤中滲出的溶液倒回營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，以防鹽分流失。處理45 d后進(jìn)行生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的測(cè)定。

從剩余5缽中取上述同樣標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)生苗，每缽3株，將其根部直接浸于預(yù)先裝有不同濃度堿液的三角瓶中進(jìn)行脅迫處理，對(duì)照組浸于蒸餾水中。待處理12 h后有幼苗葉片開始發(fā)黃或者萎蔫時(shí)，取幼苗中上部第2節(jié)完好葉片，切成適當(dāng)小段備用于超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及超微結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1 植株生長(zhǎng)及生理指標(biāo)測(cè)定 分別于堿脅迫試驗(yàn)前和結(jié)束后測(cè)量幼苗株高；試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理隨機(jī)選取幼苗3株，蒸餾水沖洗干凈，置105 ℃烘箱殺青15 min，90 ℃烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算單株生物量。

根系活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑法；電解質(zhì)滲透率測(cè)定采用電導(dǎo)儀法；葉綠素含量測(cè)定采用乙醇-丙酮混合液法；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法；脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法[5]。

1.3.2 透射電鏡樣品的制備與觀察 取各處理葉片相同部位(避開葉脈)切成1 mm×3 mm的矩形小塊，樣品在3%的戊二醛溶液中4 ℃固定24 h以上，0.1 mol/L(pH=7.0)磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸固定2 h后，重復(fù)使用0.1 mol/L(pH=7.0)磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min。再以30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇逐級(jí)脫水1次，每級(jí)15 min，100%乙醇脫水2次，每次20 min[6]。之后進(jìn)行EPON812環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合，萊卡EMUC6超薄切片機(jī)切片(切片厚度為70～90 nm)，收集到鎳網(wǎng)上，經(jīng)醋酸鈾30 min、檸檬酸鉛10 min雙重染色，最后利用日立H-600透射電鏡進(jìn)行觀察，拍片[6]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用方差分析和Duncan′s多重檢驗(yàn)，在P<0.05時(shí)用R 3.3.1對(duì)每個(gè)參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。參數(shù)值以標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)唐古特白刺生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響

由圖1可知，唐古特白刺株高、生物量、根系活力及葉綠素含量隨堿脅迫濃度的增大而下降，且均顯著低于對(duì)照組。其中，>300 mmol/L的堿脅迫濃度對(duì)生物量抑制作用極為顯著，生物量降幅達(dá)61.8%～81.8%。根系活力對(duì)堿脅迫較敏感，200 mmol/L時(shí)即顯著下降，降幅為58.3%，500 mmol/L時(shí)降幅可達(dá)83.3%。葉綠素含量隨堿脅迫濃度的增大存在22.0%～54.5%的降幅，但300 mmol/L和400 mmol/L堿脅迫處理間無顯著差異。

與對(duì)照相比，堿脅迫能引起唐古特白刺葉片丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率的增加，且不同濃度處理間存在顯著差異(圖1)。隨堿脅迫濃度的增大，丙二醛含量存在21.4%～114%的增幅，而電解質(zhì)滲透率在堿脅迫200 mmol/L時(shí)即存在55.6%的增幅，500 mmol/L時(shí)增幅可達(dá)100%。

由圖2可知，唐古特白刺葉片SOD、CAT活性和脯氨酸含量呈堿脅迫低濃度上升、高濃度下降趨勢(shì)。與對(duì)照相比，除500 mmol/L堿脅迫外，其余脅迫濃度均可誘導(dǎo)這3個(gè)指標(biāo)的顯著增加，且不同脅迫濃度間差異顯著。其中，CAT活性在堿脅迫200 mmol/L時(shí)增幅即為220%，300 mmol/L時(shí)活性達(dá)到最大，增幅為560%；而葉片SOD活性和脯氨酸含量在堿脅迫400 mmol/L時(shí)才達(dá)到最大，二者的增幅分別為250%和100%。

2.2 堿脅迫對(duì)唐古特白刺葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜的變化 對(duì)照組中唐古特白刺葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁光滑且透亮，細(xì)胞質(zhì)膜無褶皺或突起(圖3)。堿脅迫200 mmol/L時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷或向內(nèi)折疊不明顯，很少有質(zhì)膜突起；堿脅迫300 mmol/L時(shí)細(xì)胞壁有黑色顆粒出現(xiàn)；堿脅迫400 mmol/L時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜突起呈大小、形狀不一的小泡，細(xì)胞壁不再光滑，有溶解跡象；堿脅迫500 mmol/L時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜褶皺或突起明顯，細(xì)胞壁層次變得模糊(圖3)。

2.2.2 葉肉細(xì)胞葉綠體形態(tài)及其分布的變化 對(duì)照組中唐古特白刺葉肉細(xì)胞葉綠體為香蕉形，短軸約為長(zhǎng)軸的1/4，分布在與空氣接觸的細(xì)胞壁一邊(圖4)。隨堿脅迫濃度的增加，葉綠體開始膨脹、變形并脫離質(zhì)膜。與對(duì)照相比，葉綠體在堿脅迫300 mmol/L時(shí)開始腫脹變形為腎形，400 mmol/L時(shí)變?yōu)辇敱承危?00 mmol/L時(shí)變?yōu)榛ㄉ?，短軸和長(zhǎng)軸比例失衡，整個(gè)葉綠體離開質(zhì)膜，且在400 mmol/L脅迫時(shí)個(gè)別葉綠體甚至游離向細(xì)胞中央的位置靠攏(圖4)。

圖1 堿脅迫對(duì)唐古特白刺株高、生物量、根系活力、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、丙二醛含量以及電解質(zhì)滲透率的影響Fig.1 Effects of alkali stress on plant height, biomass, root activity, chlorophyll content, MDA (malondialdehyde) content and electrolyte permeability of Nitraria tangutorum

圖2 堿脅迫對(duì)唐古特白刺SOD、CAT活性和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of alkali stress on SOD (superoxide dismutase), CAT (catalase) activity and proline content of Nitraria tangutorum

CW: 細(xì)胞壁 Cell wall. CM: 細(xì)胞膜 Cell membrane.圖3 不同濃度堿脅迫下唐古特白刺葉肉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的變化Fig.3 Mesophyll cell wall and cell membrane changes of Nitraria tangutorum under different alkali stress

GL: 基粒片層 Grana lamella. Ch: 葉綠體 Chloroplas. SL: 基質(zhì)片層 Stroma lamellae. SG: 淀粉粒 Starch granules. P: 質(zhì)粒 Plastoglobules. 圖4 不同濃度堿脅迫下唐古特白刺葉綠體形態(tài)和分布的變化Fig.4 Mesophyll chloroplast morphology and distribution of Nitraria tangutorum under different alkali stress

2.2.3 葉肉細(xì)胞葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)的變化 對(duì)照組中唐古特白刺葉肉細(xì)胞葉綠體外膜完整平滑，無折疊現(xiàn)象，膜間隙與基質(zhì)被內(nèi)膜明顯隔離開，基質(zhì)呈均質(zhì)狀，類囊體沿葉綠體長(zhǎng)軸平行有序排列，基粒片層結(jié)構(gòu)緊致清晰(圖4)?；ｎ惸殷w在堿脅迫300 mmol/L時(shí)排列散亂，400 mmol/L時(shí)出現(xiàn)囊泡化，500 mmol/L時(shí)有溶解，片層結(jié)構(gòu)消失跡象(圖4)。

2.2.4 葉肉細(xì)胞葉綠體淀粉粒和嗜鋨顆粒的變化 300 mmol/L堿脅迫時(shí)唐古特白刺葉肉細(xì)胞葉綠體中間膨大部位出現(xiàn)淀粉粒，淀粉粒長(zhǎng)度約為葉綠體長(zhǎng)度的1/5，沿葉綠體長(zhǎng)軸分布(圖4)。其他濃度堿脅迫下葉綠體中未見淀粉粒的出現(xiàn)。堿脅迫處理下，葉綠體中均出現(xiàn)嗜鋨顆粒，且其數(shù)量、體積較對(duì)照都有不同程度增加。堿脅迫400 mmol/L和500 mmol/L時(shí)有大量嗜鋨顆粒集聚成堆出現(xiàn)(圖4)。

3 討論

3.1 堿脅迫下唐古特白刺的生長(zhǎng)及生理響應(yīng)

生長(zhǎng)抑制是植物在鹽堿脅迫下的綜合表現(xiàn)[7]，本研究中堿脅迫后唐古特白刺株高、生物量的降低即是最好的例證。逆境除抑制植物生長(zhǎng)外，還會(huì)引起一系列的生理代謝紊亂，而植物通過相應(yīng)的生理變化來適應(yīng)或抵制逆境脅迫[8]。非生物脅迫中，根系是首先并直接遭受傷害的部位[9]。低濃度堿脅迫時(shí)唐古特白刺根系活力即顯著下降，可能由于堿脅迫造成其根系周圍的高pH值引起金屬離子和磷的積累，損害根部組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致根系吸收功能減弱，根系活力降低[10]。葉綠素是光合作用的主要色素[11]，隨堿脅迫濃度的增大，其含量減少，可能由于堿脅迫使葉綠素酶活性降低，葉綠素分解加速，或者堿脅迫使其葉綠體蛋白和葉綠素結(jié)合受到影響，導(dǎo)致更多的葉綠素受損[12]。另有研究表明，堿脅迫處理可能打破了鎂離子在植物體內(nèi)的正常狀態(tài)，從而導(dǎo)致葉綠素形成受阻[11]。同時(shí)，唐古特白刺葉片MDA含量及電解質(zhì)滲透率隨堿脅迫濃度的增大而持續(xù)上升，這與張磊等[10]的研究結(jié)果相似，即堿脅迫濃度的增大會(huì)加劇膜脂過氧化程度，破壞質(zhì)膜的選擇透過性，導(dǎo)致電解質(zhì)大量外滲，加劇對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度。

本研究中，唐古特白刺葉片SOD和CAT活性在低濃度堿脅迫時(shí)上升，高濃度堿脅迫時(shí)下降。由此可知，一定濃度的堿脅迫可以誘導(dǎo)SOD和CAT活性的增加。SOD和CAT作為生物防御體系的關(guān)鍵酶，可有效保護(hù)細(xì)胞免受活性氧傷害[13]。低濃度堿脅迫時(shí)，唐古特白刺可能通過增強(qiáng)SOD和CAT酶活性以消除和轉(zhuǎn)化超氧陰離子及過氧化氫，維持細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)。但高濃度堿脅迫時(shí)，細(xì)胞代謝紊亂加劇，產(chǎn)生過多超氧陰離子及過氧化氫，使SOD和CAT大量消耗，同時(shí)，膜脂過氧化加劇，膜系統(tǒng)損傷加重，影響SOD和CAT的分泌和激活過程，從而導(dǎo)致SOD和CAT活性的下降[13]。另試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，300 mmol/L堿脅迫時(shí)唐古特白刺葉片CAT活性顯著升高，其原因可能是CAT對(duì)過氧化氫親和力較低，只有當(dāng)SOD分解超氧陰離子產(chǎn)生的過氧化氫得到積累時(shí)CAT活性才能被大幅度激活。

脯氨酸(proline)是植物在逆境脅迫下累積的主要有機(jī)分子[14]。曲元?jiǎng)偟萚9]研究發(fā)現(xiàn)，Na2CO3引起的Pro增加幅度遠(yuǎn)大于NaCl，認(rèn)為Pro是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)pH的一種緩沖物質(zhì)。本研究中，Pro含量在堿脅迫濃度≤400 mmol/L時(shí)得以積累可能由于較低濃度的堿脅迫促使Pro合成酶的活化，抑制Pro的生物降解造成的[8]。也有研究表明，逆境脅迫導(dǎo)致線粒體膜對(duì)Pro選擇透性下降也是造成胞質(zhì)內(nèi)Pro積累的重要原因[15]。500 mmol/L堿脅迫時(shí)Pro含量減少可能由于高濃度堿脅迫下細(xì)胞代謝紊亂，葉綠體、線粒體結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，酶活性降低，而催化Pro合成的酶位于胞質(zhì)或葉綠體中,氧化降解酶位于線粒體中[15]，導(dǎo)致Pro合成受阻，含量減少。

3.2 堿脅迫下唐古特白刺超微結(jié)構(gòu)的變化

膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的破壞，是植物受到鹽害的普遍特征，其破壞程度與植物的耐鹽堿性息息相關(guān)[16]。唐古特白刺經(jīng)堿脅迫后，細(xì)胞壁不再光滑，出現(xiàn)沉淀或溶解趨勢(shì)；細(xì)胞質(zhì)膜則出現(xiàn)褶皺或突起產(chǎn)生形狀、大小不一的小泡，其中以高濃度脅迫時(shí)變化最為顯著。這些變化不僅說明堿脅迫對(duì)唐古特白刺細(xì)胞壁及質(zhì)膜造成一定損傷，也說明其利用自身結(jié)構(gòu)的改變來積極適應(yīng)不良環(huán)境，既可以消除過多破損的膜，加快更新，也可以把過多的鹽分收集在液泡中，提高液泡濃度，增加細(xì)胞的滲透勢(shì)[17]。

葉綠體是眾多細(xì)胞器中對(duì)鹽堿脅迫最為敏感的[18]。近年來研究者們通過對(duì)逆境脅迫下桂花(Osmanthusfragrans)[16]、核桃(Juglansregia)[19]、棉花(Gossypiumhirsutum)[20]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[21]等葉綠體超微結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)由于不同植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力不同，導(dǎo)致葉綠體形態(tài)變化存在差異，同時(shí)，逆境脅迫可導(dǎo)致葉綠體類囊體排列松散變形，基粒片層垛疊數(shù)量減少或模糊不清，破壞葉綠體被膜甚至失去完整膜結(jié)構(gòu)等[16]。筆者發(fā)現(xiàn)，堿脅迫處理下的唐古特白刺葉綠體由香蕉形變?yōu)槟I形、龜背形和花生形不等，這首先從外部輪廓上印證了不同濃度堿脅迫對(duì)葉綠體損傷程度的大小不一。其次，各堿脅迫濃度下葉綠體均不同程度的剝離細(xì)胞壁，而植物葉綠體通常緊貼細(xì)胞壁分布于與空氣接觸的質(zhì)膜旁，這樣的分布有利于葉綠體與外界進(jìn)行氣體交換，當(dāng)葉綠體離開質(zhì)膜時(shí)，葉綠體內(nèi)正常光合運(yùn)轉(zhuǎn)功能可能受阻。葉綠體剝離細(xì)胞壁可能是由于隨堿脅迫濃度的增加，葉綠體膜受損發(fā)生滲漏，體積縮小造成的。

300 mmol/L堿脅迫時(shí)唐古特白刺葉綠體中淀粉粒的出現(xiàn)，可能由于線粒體膜受到損傷，出現(xiàn)能量供應(yīng)障礙，導(dǎo)致光合產(chǎn)物以淀粉粒的形式沉積，也可能是由于葉綠體結(jié)構(gòu)受損，高濃度鹽堿阻礙淀粉的水解和向外運(yùn)輸造成的[7]。葉綠體內(nèi)淀粉粒補(bǔ)償性增多，體積變大，可彌補(bǔ)逆境脅迫造成的能量供應(yīng)不足，提高細(xì)胞質(zhì)濃度，保證水和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)的供給[13]。未脅迫時(shí)，唐古特白刺葉綠體中嗜鋨顆粒數(shù)量相對(duì)較少，體積相對(duì)較小，而高濃度堿脅迫時(shí)數(shù)量增多，體積變大，且集聚成堆出現(xiàn)。嗜鋨顆粒的存在可以提供脂質(zhì)供膜的更新，以保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)，逆境脅迫時(shí)嗜鋨顆粒會(huì)降解為糖，提高細(xì)胞中糖的濃度，進(jìn)而增加植物的抗性[17]。因此，淀粉粒的出現(xiàn)和嗜鋨顆粒的增多變大對(duì)唐古特白刺完成在極端環(huán)境下的生活史意義重大[6]，也進(jìn)一步驗(yàn)證了唐古特白刺具有一定的耐鹽堿性。

4 結(jié)論

低濃度堿脅迫對(duì)唐古特白刺生長(zhǎng)具有一定抑制作用，≥300 mmol/L的堿脅迫濃度對(duì)白刺生長(zhǎng)及葉片超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的抑制及損傷。堿脅迫下SOD、CAT活性和Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，嗜鋨小體增多變大以及淀粉粒的出現(xiàn)，表現(xiàn)唐古特白刺對(duì)堿脅迫有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。