周善金 李海 顧建忠 韋福相 邱迎均 潘春玲 黎飚 方曉燕
(右江民族醫(yī)學院組織胚胎學教研室,廣西 百色 533000)
阿爾茨海默病(AD)患病率隨著年齡增大明顯升高,老年女性發(fā)病率更高,臨床表現(xiàn)更重。沉積于海馬區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)引起思維、語音中樞的損傷是AD的病因之一〔1~3〕。本研究主要觀察山茶籽提取物對雌激素缺乏AD模型鼠的學習行為能力、對應組織的Aβ沉積的影響,為臨床防療AD提供新的治療方案,無毒高效地提高AD女性患者生活質(zhì)量,使茶麩變廢為寶,為廣大山區(qū)脫貧綠色生態(tài)產(chǎn)業(yè)帶來經(jīng)濟效益和社會效益。
1.1實驗動物飼養(yǎng) SD大鼠,SPF級5月齡雌性大鼠32只,體重(350±10)g。在室溫(25±3)℃、燈光每12 h 進行交替,相對濕度58%的條件中給予全效顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。
1.2雌激素缺乏AD大鼠模型的建立 取24只大鼠在麻醉條件下(10 g/L 戊巴比妥鈉通過腹腔注射,3.0 mg/kg),常規(guī)消毒,切掉兩側(cè)卵巢,縫合創(chuàng)口。切片鏡下鑒定切除組織塊為卵巢。術后創(chuàng)口處用鏈霉素治療3 d,避免創(chuàng)口感染。去卵巢后2 w,按上述方法麻醉(3.0 mg/kg),固定于腦定位器上,頭顱正頂部中央切前囟口暴露腦組織,以前囟為中心,向后4.3 mm、再旁開2.1 mm兩邊為穿刺點,打孔鉆開顱骨。距離腦膜表面針入3.0 mm到達海馬區(qū)雙側(cè),用Aβ25~35 1 μl(含量為10 μg)緩緩注入海馬區(qū)雙側(cè),留針片刻(5 min),使Aβ25~35充分局部浸潤。③造模大鼠顱內(nèi)注射3 d后,再用D-半乳糖腹腔注射,注射液用D-半乳糖(100 mg/kg)+生理鹽水稀釋至2 ml,1次/d,連續(xù)2 w。對照組大鼠與去卵巢+D-半乳糖聯(lián)合造AD模大鼠的摘除卵巢的手術操作過程一樣,不同是切除卵巢附近一塊脂肪組織,同樣定位開顱,在相應部位注射等量鹽水,沒有注射Aβ25~35。
1.3動物分組及給藥 造模+山茶籽干預(山茶籽)組用相當于生藥5 g/g山茶籽的水溶液定時定量灌胃〔10 ml/(kg·d)〕;造模+雌二醇干預(雌二醇)組用雌二醇皮下注射200 μg/kg,2次/w;對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組造模后均給藥12 w。
1.4Morris水迷宮試驗 各實驗大鼠在造模后給藥前及給藥12 w時全部進行Morris 水迷宮,測定大鼠學習行為能力。在水迷宮中央放置圓形的平臺深度位于1.5 cm水下處,測定大鼠空間行為能力和空間判斷記憶能力。
1.5免疫組化觀察不同組海馬區(qū)腦組織切片Aβ陽性細胞 灌注排血取腦,麻醉大鼠后,切開胸腔心臟,用500 ml生理鹽水快速灌注。灌注后斷頭常規(guī)取腦,左腦用10%甲醛固定腦組織,脫水、包埋和切成腦組織片。右大腦勻漿測定Aβ。海馬區(qū)腦組織切片免疫組化染色,將海馬區(qū)腦組織切片室溫中干燥1.5 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,每次20 min。將山羊血清(混有0.1%TritonX-100)注入組織片上并進行35~50 min孵育。滴入抗Aβ抗體(1∶400)4℃條件下孵育一夜。第2天,用Cy3 標記的二抗體(1∶200)在濕盒中進行2~3 h孵育。最后,免疫染色切片顯微鏡觀察切片陽性細胞,進行Aβ陽性細胞計數(shù)。
1.6Western印跡法檢測Aβ 右側(cè)海馬區(qū)組織在低溫條件下進行勻漿并提取Aβ進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。凝膠置電泳槽里,并注入緩沖電泳液檢查其密封性。向電泳樣本加入適當5×結(jié)合緩沖液,煮沸時間10 min,進行離心分離。在泳道注入40 μg Aβ,蛋白條帶至中間部位即可斷電。剪濾紙與聚偏氟乙烯(PVDF)膜一樣大小,并在甲醇溶液中浸泡PVDF 膜5 min左右,夾子內(nèi)部海綿、濾紙、凝膠板、PVDF 膜、濾紙按順序排列。通電90 min,電壓100 V電泳。室溫轉(zhuǎn)膜后,5%牛奶液中進行封閉2 h,加入一抗孵育4℃過夜(其中兔抗Aβ單克隆抗體1∶400;兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體1∶10 000)。用TBST洗滌3次。加入酶標記兔二抗(1∶20 000)孵育2 h。同樣洗滌3次。觀察凝膠成像,掃描觀察灰度。
1.7統(tǒng)計學方法 采用SSPS19.0軟件進行方差分析和t檢驗。
2.1各組大腦組織結(jié)構(gòu)比較 對照組神經(jīng)細胞大小、分布和數(shù)量正常,模型組神經(jīng)細胞數(shù)量減少,大量神經(jīng)元纖維纏結(jié),而山茶籽組和雌二醇組的神經(jīng)細胞大小、分布和數(shù)量與對照組相近。見圖1。
圖1 各組大腦組織結(jié)構(gòu)(HE,×100)
2.2各組腦組織Aβ蛋白表達比較 見圖2。模型組Aβ電泳條帶較對照組顯著增強,山茶籽組及雌二醇組Aβ條帶與對照組接近。
2.3各組水迷宮實驗 見表1。對照組給藥前后到達時間和錯誤率沒有顯著差別(P>0.05);模型組治療前后到達時間和錯誤率有顯著差別(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,山茶籽組及雌二醇組治療后錯誤率均明顯降低(P<0.01);與雌二醇組比較,山茶籽組用藥后錯誤率無明顯差異(P>0.05)。
圖2 Western印跡檢測各組Aβ蛋白表達
表1 各組到達中央平臺時間和錯誤率比較
2.4各組海馬區(qū)組織切片Aβ陽性細胞計數(shù)比較 與對照組〔(8.33±0.62)個〕比較,模型組海馬區(qū)組織切片Aβ陽性細胞計數(shù)〔(72.10±8.79)個〕顯著增多(P<0.01);與模型組比較,山茶籽組〔(21.32±3.05)個〕及雌二醇組〔(17.19±1.03)個〕Aβ陽性細胞計數(shù)顯著減少(P<0.01)。
去卵巢模擬老年女性卵巢功能退化加常規(guī)用D-半乳糖+Aβ聯(lián)合造AD模,結(jié)果AD模型大鼠學習行為和記憶能力下降明顯,海馬組織Aβ沉積增加明顯,其陽性細胞增加,相應 Aβ電泳帶光密度明顯增加,說明此方法造AD模成功。
雌激素缺乏AD模型經(jīng)山茶籽提取液干擾后,大鼠記憶行為和學習能力提高,海馬區(qū)組織神經(jīng)細胞數(shù)量增加,神經(jīng)纖維纏結(jié)減少,海馬區(qū)Aβ免疫組織化學染色顯示Aβ染色細胞數(shù)量下降,說明山茶籽對AD大鼠治療效果顯著,山茶籽發(fā)揮雌激素樣作用抑制膽堿酶,增加膽堿在腦組織的生理活性濃度,提高腦中樞組織生理活動〔4〕,從而表現(xiàn)為學習行為和記憶能力提高;雌激素大量羥基發(fā)揮抗氧化功能〔5〕,抑制半乳糖和Aβ沉積物對神經(jīng)組織的傷害,抑制AD發(fā)生和發(fā)展;雌激素有擴張血管,增血流的功效,減少Aβ對腦組織在大腦組織堆積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑生成〔6,7〕;山茶籽發(fā)揮其雌激素樣作用增加中樞神經(jīng)細胞α酶的分泌,加快Aβ水解、排出,AD自然得到改善〔8〕。
綜上,山茶籽干擾AD大鼠效果良好,其原理是內(nèi)含豐富植物性雌激素。與雌二醇治療比較,山茶籽治療AD作用效果相近,也從另一方面說明山茶籽內(nèi)含雌激素〔9〕,而且山茶籽無雌激素的毒副作用,為老年女性AD防治提供新方案,還可以發(fā)揮山茶籽綠色生態(tài)扶貧產(chǎn)業(yè)作用。