微生態(tài)制劑對小鼠潰瘍性結腸炎的作用

陳巖勤 李玉桂 楊盛剛 王聰 高秀麗,2,3

(貴州醫(yī)科大學 1藥學院，貴州 貴陽 550025；2微生物與生化藥學工程中心；3藥用植物功效與利用國家重點實驗室)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種以腹痛、腹瀉、便血等為特征的易復發(fā)性炎癥性腸病〔1〕，近幾年尤其是在亞洲，南美和中東地區(qū)其發(fā)病率持續(xù)上升〔2,3〕。迄今UC尚缺乏有效的藥物來治愈，研究者認為UC的病因和發(fā)病機制與遺傳因素、環(huán)境因素、腸道菌群和異常免疫反應等多種因素有關〔4〕。 UC患者與正常人群相比腸道中條件致病菌數(shù)量明顯增多，而且雙歧桿菌、乳酸菌等腸道正常菌群的數(shù)量明顯下降〔5,6〕。秦廣大等〔7〕將枯草桿菌和屎腸球菌(美常安)與青春雙歧桿菌(麗珠腸樂)分別與柳氮磺胺吡啶聯(lián)用治療30例輕中度活動期UC患者，結果表明使用柳氮磺胺吡啶聯(lián)合微生態(tài)制劑用于輕中度活動期UC的臨床療效優(yōu)于單獨使用柳氮磺胺吡啶。房玉海〔8〕將美沙拉嗪與美常安聯(lián)合運用治療94例UC患者1個月，結果表明不良反應相對較少。另有研究表明中藥小檗堿通過調節(jié)腸道菌群〔9〕和調節(jié)免疫應答〔10～14〕對UC具有良好的療效。本課題組通過建立與人類UC相似的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導動物UC模型，探討微生態(tài)制劑治療UC的作用效果，為后續(xù)微生態(tài)制劑的實驗研究和臨床合理應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 70只SPF級雌性昆明小鼠，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體重(20±2.0)g，動物合格證號：SYXK(黔)2018-0001。

1.1.2藥物、試劑及儀器 DSS(上海翊圣生物科技有限公司，D9606)；柳氮磺胺吡啶(上海福達制藥有限公司，22160610)；鹽酸小檗堿片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，2160929)；乳酸菌(商品名：聚克，江蘇美通制藥有限公司，170617)；枯草桿菌(商品名：枯草桿菌，華潤紫竹藥業(yè)有限公司，53160601)；地衣芽孢桿菌(商品名：地衣芽孢桿菌，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，201706100)；白細胞介素(IL)-17A(037864)、IL-6(002293)、IL-10(002285)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(002095) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。酶標儀(RT-6100)由Rayto公司生產(chǎn)；TG16W 微量高速離心機由三和儀器源頭廠家生產(chǎn)；石蠟切片機由LEIKA公司生產(chǎn)；HT-200 恒溫搖床源于赫田儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1模型動物分組 小鼠適應性喂養(yǎng)1 w，隨機抓取分組，每組10只，分為對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組。動物實驗遵循貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會章程。

1.2.2造模及用藥 對照組自由飲用無菌蒸餾水，每日同時間點給予生理鹽水，灌胃體積0.2 ml/10 g，連續(xù)灌服7 d；模型組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點給予生理鹽水，灌胃體積0.2 ml/10 g，連續(xù)灌服7 d；柳氮磺胺吡啶組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按100 mg/kg、0.2 ml/10 g劑量連續(xù)灌服7d柳氮磺胺吡啶藥物；小檗堿組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按15 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續(xù)灌服7 d小檗堿；乳酸菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按33 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續(xù)灌服7 d乳酸菌；枯草桿菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按30 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續(xù)灌服7 d枯草桿菌；地衣芽孢桿菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按25 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續(xù)灌服7 d地衣芽孢桿菌。

1.2.3疾病活動指數(shù)(DAI)評分 每日記錄小鼠體重，觀察腹瀉情況、大便性狀及便血狀況，參照評分系統(tǒng)〔15〕，進行疾病活動指數(shù)評估。

1.2.4ELISA檢測血清IL-17A表達水平 依照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.5結腸IL-6、IL-10、TNF-α水平含量測定 取0.2 g結腸，加入5 ml生理鹽水用勻漿器勻漿充分，然后以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，檢測具體操作依照說明書進行。

1.2.6結腸形態(tài)觀察 取處死小鼠整段結腸，測量長度并做記錄，觀察各組小鼠結腸形態(tài)：黏膜是否光滑完整，有無糜爛、潰瘍、水腫等現(xiàn)象。

1.2.7結腸蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 用預冷生理鹽水將結腸洗凈，于結腸末端(距肛門1 cm)處剪取0.5 cm長結腸，10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片，采用HE染色法染色，光鏡下觀察。

1.3數(shù)據(jù)處理 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1DAI評分情況 飲用3.5%DSS溶液的各組小鼠第2天大便開始偏潤，活動量與飲水量均減少。隨實驗天數(shù)增加，模型組癥狀逐漸加劇，幾乎出現(xiàn)血便或隱血現(xiàn)象；7 d后各組腹瀉發(fā)生率、便血率均比模型組低，其中小檗堿組和乳酸菌組腹瀉發(fā)生率和便血率最低，地衣芽孢桿菌組介于之間。見表1；DAI評分結果見表2，與模型組比較用藥組均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠腹瀉率、便血率(%)

2.2血清IL-17A測定結果 模型組血清IL-17A含量明顯高于使用各種藥物干預的治療組(P<0.05)。見表2。

2.3小鼠結腸組織IL-6、IL-10、TNF-α測定結果 柳氮磺胺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組的細胞因子IL-6、TNF-α含量較模型組均明顯下降(P<0.05)，而IL-10含量水平明顯上升(P<0.05)。 見表2。

表2 各組小鼠DAI評分、IL-17A水平、結腸長度及結腸組織IL-6、IL-10、TNF-α含量水平比較

2.4各組結腸形態(tài)、長度及病理觀察 圖1可見，對照組小鼠結腸黏膜完整、光滑，沒有出現(xiàn)糜爛或者潰瘍現(xiàn)象，沒有明顯損傷，而模型組損傷現(xiàn)象較嚴重，乳酸菌組、小檗堿組出現(xiàn)糜爛或潰瘍現(xiàn)象相對較少。模型組較其他組結腸更細，結腸中已無成形糞便；對照組結腸長度較其他組都長，且糞便成形，說明該批次小鼠無健康問題，柳氮磺胺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組結腸長度與模型組比較顯著更長(P<0.05)。 見表2。

圖2可見，對照組結腸黏膜完整、連續(xù)，無炎癥細胞和潰瘍形成；模型組結腸黏膜不完整，有潰瘍形成，腺體排列無序，隱窩缺失并出現(xiàn)大量炎性細胞；其他組經(jīng)過藥物干預后炎性細胞相對減少，潰瘍嚴重程度降低，腺體破壞程度較輕，黏膜結構較完整，治療效果較好；其中乳酸菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌組別結腸狀況與柳氮磺吡啶組狀況相仿，但優(yōu)于小檗堿組。

圖1 用藥后各組結腸大體形態(tài)

圖2 各組結腸組織病理學形態(tài)(HE,×100)

3 討 論

UC病因可能與腸道微環(huán)境、飲食、遺傳、免疫等多重因素導致易感性機體對腸道黏膜抗原免疫應答失調有關，但其發(fā)病機制尚未完全清楚。根據(jù)炎性因子失衡是導致UC腸道炎癥發(fā)作的重要環(huán)節(jié)，腸道菌群失調亦會引起多種消化道炎癥性疾病〔16〕；莊鑫〔17〕通過調節(jié)患者免疫功能，控制炎性因子水平，抑制腸道炎癥，改善腸道菌群環(huán)境，減輕腸黏膜細胞損傷，改善腸道功能。本研究用不同的微生態(tài)制劑進行干預發(fā)現(xiàn)其對與UC的治療具有良好的效果。促炎因子與抗炎因子之間的平衡與UC的發(fā)病機制亦有關聯(lián)〔18〕。TNF-α由激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥反應中促使其他細胞因子釋放，形成細胞因子網(wǎng)絡，擴大炎癥連鎖反應；IL-6由活化的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能刺激巨噬細胞或單核細胞、淋巴細胞等合成前列腺素、細胞因子、血小板激活因子等炎性介質，是一種作用廣泛的促炎細胞因子〔19〕。IL-17A屬于促炎因子，由Th17細胞產(chǎn)生，能夠對UC的發(fā)生起調控作用〔20,21〕，隨著UC發(fā)病程度的加劇，IL-17A的含量持續(xù)增加〔22,23〕。UC病程發(fā)展，IL-6和TNF-α含量均隨著增高〔24,25〕。IL-10作為抗炎因子，由Th2細胞、單核-巨核細胞、B細胞分泌，研究表明IL-10含量水平的提高能有效減輕炎癥反應，益生菌或其代謝產(chǎn)物可能會通過促進IL-10表達，使其IL-10表達水平增高來達到治療UC的目的〔26,27〕。王旭霞等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌能經(jīng)過抑制細胞因子分泌來降低腸道通透性從而對腸道黏膜起保護作用。黎莉等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)降低TNF-α、IL-6含量能起到治療UC的作用，有助于結腸黏膜愈合。徐毅暉等〔30〕研究發(fā)現(xiàn)人促紅素能減少Th17分化生成IL-17A達到治療UC的目的。本研究顯示微生態(tài)制劑可以降低TNF-α、IL-6、IL-17A分泌水平，提高IL-10含量，并有助于維持腸黏膜上皮細胞的完整，保持腸黏膜屏障功能。