NLRP3基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性

賈欽堯 陳紹平 宋珊 韓美玲 李新勝

(川北醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，四川 南充 637000；2附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3武漢市肺科醫(yī)院；4安康市人民醫(yī)院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見(jiàn)的以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性炎癥性疾病，患者存在不同程度的進(jìn)行性肺功能降低及異常的對(duì)氣體和有毒顆粒的炎癥反應(yīng)，具有較高的發(fā)病率〔1〕。COPD的影響因素眾多，包括天氣、吸煙、感染、物理因素、化學(xué)因素等，其與機(jī)體免疫系統(tǒng)互相作用會(huì)誘發(fā)氣道慢性持續(xù)炎癥，導(dǎo)致氣道不完全阻塞和狹窄，支氣管軟骨受到破壞，肺組織彈性降低等，最終導(dǎo)致通氣功能下降。慢性氣道炎癥反應(yīng)被認(rèn)為在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著核心作用。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3是參與炎癥反應(yīng)的重要蛋白，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)COPD患者中NLRP3表達(dá)異常，其可能在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔2〕。王蕾等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3的表達(dá)與COPD疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。基因多態(tài)性是指存在兩種或多種不連續(xù)的變異型、基因型或等位基因，NLRP3基因的多態(tài)性與多種炎性疾病有關(guān)，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、阿司匹林誘發(fā)哮喘等，但目前有關(guān)NLRP3基因與COPD之間的關(guān)系還未見(jiàn)研究報(bào)道〔4，5〕。本研究分析了4個(gè)近年來(lái)NLRP3基因和疾病相關(guān)研究的熱點(diǎn)區(qū)域，包括rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419，應(yīng)用TaqMan探針檢測(cè)法檢測(cè)這4個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，分析NLRP3基因的多態(tài)性與COPD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選擇2017年10月至2018年10月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的COPD患者共200例作為研究組，年齡52～73歲，平均(64.78±4.03)歲，選擇同期健康者60例作為對(duì)照組，年齡55～74歲，平均(65.28±3.99)歲，兩組的一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究已經(jīng)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)符合COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕；(3)資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肺結(jié)核、哮喘、支氣管擴(kuò)張等疾??；(2)合并其他部位感染；(3)合并惡性腫瘤。

1.3研究指標(biāo) 患者在門診接受問(wèn)卷調(diào)查，收集患者一般資料，其中吸煙定義為每日吸煙量>10支，吸煙時(shí)間>10年；飲酒定義為飲酒量為4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯(56°白酒100 ml)，每周飲酒超過(guò)5次，飲酒時(shí)間超過(guò)5年。抽取患者外周靜脈血共10 ml，通過(guò)PCR-RFLP 技術(shù)檢測(cè)NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。使用酚-氯仿法從外周血淋巴細(xì)胞中提取所有參與者的基因組DNA。通過(guò)NanoDrop-2000c(Thermo Scientific，USA)檢測(cè)提取的DNA的濃度。使用0.2 μl光學(xué)96孔反應(yīng)板(ABI 7300，Biosystems，USA)進(jìn)行NLRP3(rs10754558，rs3806265，rs4612666和rs35829419)基因分型。每個(gè)微孔中的總體積為20 μl，由10 μl的MasterMix(ABI 7300，Biosystems，USA)，0.5 μl AssayMix(ABI)，4.5 μl去離子水和5 μl DNA樣品(20 ng/ml)組成。制備含有1 000 MasterMix(2×)，50 μl AssayMix(4×)和450 μl去離子水的混合物，將15 μl混合物和5 μl DNA樣品加入每個(gè)微孔中。 PCR條件如下：95℃、10 min，40個(gè)循環(huán)，95℃、15 s，60℃、1 min，使用等位基因辨別程序確定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Logistic回歸分析、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組基本資料比較 研究組吸煙比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2兩組NLRP3基因多態(tài)性分布比較 研究組NLRP3基因rs3806265位點(diǎn)的等位基因T的頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，研究組NLRP3基因rs3806265位點(diǎn)TT的基因型顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，CT基因型顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，其他點(diǎn)位基因多態(tài)性無(wú)顯著差異，見(jiàn)表2。

表1 兩組基本資料比較

表2 兩組NLRP3基因多態(tài)性分布比較〔n(%)〕

2.3COPD危險(xiǎn)因素 Logistic 回歸分析 Logistic 回歸分析結(jié)果顯示吸煙〔OR=3.056,95%CI(1.956～6.757);P=0.011〕和rs3806265位點(diǎn)TT基因型〔OR=2.341,95%CI(1.194～4.689);P=0.023〕是COPD的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

3 討 論

COPD在臨床上常表現(xiàn)為咳嗽咳痰、氣喘、呼吸困難，COPD患者若得不到有效的救治會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)及肺的纖維化，甚至導(dǎo)致呼吸衰竭，嚴(yán)重危害患者的生命健康。我國(guó)是COPD高發(fā)國(guó)家，COPD在40歲以上人群發(fā)病率高達(dá)8.2%，并且隨著空氣環(huán)境污染等原因，COPD的發(fā)病率有上升趨勢(shì)〔6〕。但是目前關(guān)于COPD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，基因多態(tài)性可能是引起COPD的因素之一。

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型成員，組成包括C-端亮氨酸重復(fù)序列、N-端PYD結(jié)構(gòu)域和中間的NACHT結(jié)構(gòu)域。經(jīng)C-端亮氨酸重復(fù)序列，NLRP3可識(shí)別三磷酸腺苷(ATP)、胞壁酰二肽(MDP)、內(nèi)毒素、尿酸、細(xì)胞裂解產(chǎn)物等配體，使其被激活并進(jìn)一步導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化，通過(guò)其PYD結(jié)構(gòu)域這一效應(yīng)結(jié)構(gòu)域其可募集帶有天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)募集結(jié)構(gòu)域(CARD)的Caspase-1和凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)，形成NLRP3炎性體這一復(fù)雜的復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3參與膿毒癥等炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔7〕。NLRP3可激活Caspase-1，激活的Caspase-1會(huì)進(jìn)一步激活白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18，導(dǎo)致促炎反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性因子會(huì)激活NLRP3，最終引起各種免疫炎癥反應(yīng)〔8〕。目前，NLRP3在慢性炎癥反應(yīng)、無(wú)菌性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病等病理過(guò)程中的意義和作用備受關(guān)注，很多感染性疾病和自身免疫性疾病都涉及到NLRP3炎性體-Caspase-1-IL18/IL-1β軸的激活。

NLRP3基因的多態(tài)性參與多種炎性疾病的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)rs10754558 隱性模型是哈薩克族老年原發(fā)性高血壓高危因素〔9〕。李賽等〔10〕研究認(rèn)為山東漢族人群NLRP3基因rs2027432位點(diǎn)多態(tài)性與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。國(guó)外也有研究顯示NLRP3基因rs4612666多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中和微栓子信號(hào)的發(fā)生有關(guān)〔11〕。Zhou等〔12〕研究認(rèn)為NLRP3 rs10754558多態(tài)性與中國(guó)漢族人群冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。已經(jīng)有研究證實(shí)NLRP3參與COPD的發(fā)生和COPD急性加重期的發(fā)生〔13〕，但是關(guān)于NLRP3基因多態(tài)性與COPD的研究極少。為了進(jìn)一步探討NLRP3基因多態(tài)性與COPD的關(guān)系，本次研究共分析了NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個(gè)對(duì)中國(guó)漢族人群重要的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，其中rs10754558被指出與人類免疫缺陷病毒(HIV)感染易感性有關(guān)，rs3806265被認(rèn)為與葡萄膜炎的發(fā)病有關(guān)，rs4612666和rs35829419則被指出與骨髓增生異常綜合征、痛風(fēng)等的易感性有關(guān)。Yu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因rs3806265位點(diǎn)的多態(tài)性與銀屑病的發(fā)生有關(guān)。Bidoki等〔15〕的研究也發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口瘡性口炎患者NLRP3 rs3806265 TT基因型的高頻率與其易感性有關(guān)。本研究提示rs3806265位點(diǎn)TT基因型是可能COPD的危險(xiǎn)因素。這一結(jié)果證實(shí)，rs3806265 SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性可能會(huì)增加COPD的風(fēng)險(xiǎn)，TT基因型是COPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。過(guò)往已經(jīng)有研究顯示吸煙是引起COPD的危險(xiǎn)因素〔16〕。研究顯示吸煙是激活NLRP3炎性小體的因素之一〔17〕。Han等〔18〕研究顯示香煙煙霧提取物通過(guò)增加泛素介導(dǎo)的蛋白酶體加工調(diào)節(jié)NLRP3蛋白豐度，這提示吸煙與NLRP3和COPD的發(fā)生有關(guān)，因此，推測(cè)分析NLRP3基因的多態(tài)性可能是連接吸煙和COPD的中間環(huán)節(jié)。