miRNA-486-3p和BIK在結直腸癌中表達及與臨床病理特征的關系

馮莉 劉妍 荊麗 韓晶 張雪 劉義冰

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 050011)

結直腸癌與胃癌和食道癌并列為三大消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴重危害人類健康。然而，結直腸癌的發(fā)病機制依舊未曾探明，現(xiàn)在常用的手術和放化療等治療手段依然存在易復發(fā)、術后轉移率高或者副作用大等問題〔1〕。因此，探究結直腸癌的發(fā)病機制，尋找預防和治療的新靶點具有重要的意義。

BCL2相互作用殺傷因子(BIK)可以通過線粒體內(nèi)途徑促進細胞凋亡，作為促凋亡腫瘤抑制因子發(fā)揮作用〔2〕。在腎細胞癌〔3〕和腦膠質(zhì)細胞瘤〔4〕中均觀察到BIK的下調(diào)。miRNA是一類20～25個核苷酸的非編碼小RNA，參與細胞代謝、分化、增殖、凋亡等多個環(huán)節(jié)〔5〕。miRNA-486-3p參與宮頸癌〔6〕、口腔鱗癌〔7〕等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。除此之外，還在急性心肌梗死〔8〕、自閉癥〔9〕等疾病中異常表達。本文通過檢測結直腸癌患者癌組織miRNA-486-3p和BIK的表達，研究miRNA-486-3p和BIK在結直腸癌中的作用。

1 材料與方法

1.1標本來源 組織標本收集2017年10月至2018年10月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院收治的83例結直腸癌患者納入研究，收集外科手術切除的結直腸癌及距癌組織邊緣5 cm的癌旁正常組織。標準：(1)患者經(jīng)過病理學確診；(2)未接受放化療?；颊吣挲g50～72歲，其中男51例，女32例。腫瘤TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，Ⅳ期8例。局部浸潤：T1 10例，T2 22例，T3 30例，T4 21例。有淋巴結轉移42例。低度分化18例、中度分化37例、高度分化28例。血清標本同樣來自以上83例患者，對照血清標本來自于同年齡階段未患結直腸癌的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，受試者簽署知情同意書。

1.2試劑 FAST1000試劑盒(先鋒生物)，Affymetrix逆轉錄試劑盒(Qiagen)，Micrornas Real-time PCR Assay Kit(艾德萊生物)。放射性免疫沉淀法(RIPA)裂解液(Solarbio)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(Solarbio)，絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)、cocktail蛋白酶抑制劑(Solarbio)。BIK一抗(ab52182)，GAPDH一抗(ab9485)。

1.3RNA提取 使用FAST1000提取組織 RNA。稱重100 mg組織加入裂解液并研磨，吸取裂解液后加入氯仿，混勻離心，加聚合液移至內(nèi)套管，洗脫液洗2次，離心后將內(nèi)套管移入EP管并加洗脫液，靜置后離心。分光光度計測定濃度。同樣根據(jù)說明書提供步驟，提取血清RNA。

1.4RT-PCR 使用Affymetrix逆轉錄試劑盒按照說明書提供的方法進行逆轉錄。程序為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。使用Micrornas Real-time PCR Assay Kit在ABI step one熒光定量PCR儀上擴增。體系如下：2 μl cDNA模板，正反各1 μl引物，10 μl miRNA qPCR Mix，7 μl H2O。反應條件為：(1)94℃ 3 min，(2)94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s(40個循環(huán))。U6為內(nèi)參基因，癌旁正常組織為對照，用2-△△Ct法計算表達水平。U6引物：正義鏈5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′、反義鏈5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；miRNA-486-3p引物：正義鏈：5′-ATAAATCGGGGCAGCTCAGTA-3′、反義鏈：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′。

1.5蛋白提取 PMSF：cocktail：RIPA裂解液=1∶1∶100的比例混合后加入盛有組織的EP管中，研磨后超聲，14 000 r/min離心10 min，取出上清轉移至新的預冷EP管，使用BCA蛋白定量試劑盒測濃度后，一溴三巰與蛋白按照1∶10混合，120℃煮10 min。

1.6Western印跡 使用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，分離后轉移蛋白至硝酸纖維素膜，在室溫使用3%(BSA)封閉30 min，4℃孵育一抗(anti-BIK，ab52182，1∶1 000，abcam；GAPDH，ab9485，1∶2 000，abcam)16 h。TBST洗10 min，三遍，室溫孵育二抗(800R/800M，1∶10 000，Odyssey)1 h，TBST洗10 min，三遍，Odyssey紅外成像檢測。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t、方差分析。

2 結 果

2.1miRNA-486-3p和BIK在結直腸癌組織中的表達 結直腸癌患者癌組織miRNA-486-3p的相對表達水平為(7.14±0.87)，癌旁正常組織表達水平為(1.00±0.51)，癌組織較癌旁正常組織miRNA-486-3p水平顯著增加(P<0.01)。結直腸癌患者癌組織BIK的相對表達水平為(0.54±0.87)，癌旁正常組織表達水平為(1.00±0.69)，癌組織較癌旁正常組織水平顯著降低(P<0.01)。

2.2miRNA-486-3p和BIK表達與臨床病理關系的單因素分析 結直腸癌組織miRNA-486-3p和BIK表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度無明顯關系(P>0.05)。隨著患者腫瘤分期增大，結直腸癌組織的miRNA-486-3p表達明顯增加，BIK表達明顯降低(P<0.01)。隨著分化程度增高，結直腸癌組織的miRNA-486-3p表達明顯增加，BIK表達明顯降低(P<0.01)。有淋巴結轉移的患者較無淋巴結轉移患者的結直腸癌組織miRNA-486-3p、BIK表達明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 miRNA-486-3p、BIK表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3血清中miRNA-486-3p的表達與臨床病理關系的單因素分析 結直腸癌患者血清中miRNA-486-3p表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度、分化程度、有無淋巴結轉移無明顯關系(P>0.05)。但隨著腫瘤分期增大，患者血清中miRNA-486-3p表達明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 血清中miRNA-486-3p表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

3 討 論

結直腸癌是全球第三大最常見的癌癥，也是第四大最常見的癌癥死亡原因，每年約有120萬新發(fā)病例和60萬死亡病例。50歲以下人群中其發(fā)病率較低，但隨著年齡增大呈強增長趨勢〔10〕。BIK也是miRNA-486-3p的靶基因之一〔11〕，它是一種可以誘導細胞凋亡的腫瘤抑制因子。BIK屬于BH3-only促凋亡蛋白家族，它可以與BCL-2、腺病毒E1B-19K，BCL-xL及其他抗凋亡蛋白相互作用，并在自主表達時產(chǎn)生強大的細胞死亡活性〔12〕。BIK在靈長類動物中高度保守，而且BIK二級結構預測表明哺乳動物中BIK結構具有相似性。BIK主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，介導線粒體的凋亡信號〔13〕。通過Western印跡證實了BIK在結直腸癌組織中表達下調(diào)。

本研究結果提示miRNA-486-3p/BIK與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展和分化有關，與腫瘤分期、分化程度、有無淋巴結轉移密切密切相關。miRNA-486-3p在結直腸癌中的高表達起到了致癌基因的作用，加速了腫瘤的惡化，為我們在分子水平治療結直腸癌提供了分子依據(jù)。我們可以通過下調(diào)miRNA-486-3p水平達到沉默其致癌基因的作用，或者上調(diào)BIK水平促進腫瘤細胞凋亡，以達到治療目的。此外，結直腸癌患者血清中miRNA-486-3p表達量升高，與腫瘤分期密切相關。雖然miRNA-486-3p可能在將來作為腫瘤標志物，但是本研究收集的病例中，分期越晚，miRNA-486-3p水平越高，對組織中的miRNA檢測還無法滿足早期診斷需要，而早期結直腸癌外周血中miRNA的表達雖然也有升高但不夠顯著，想達到更早的診斷與更好的治療效果還需進一步研究。