Wnt3a重組蛋白溶劑對腦梗死模型大鼠干預(yù)效果及作用機制

袁小冬 趙俊杰 羅孜賢 張宴斌

(杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 311100；2邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院高新醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦梗死是臨床中常見的一種腦血管疾病，具有較高的發(fā)病率、死亡率及致殘率，對人們的身體健康和心理產(chǎn)生嚴重的危害〔1〕，已經(jīng)成為全球研究的重中之重。目前在臨床中治療腦梗死主要采用溶栓治療，神經(jīng)影像學(xué)檢查等，但是大部分患者神經(jīng)功能恢復(fù)的效果均不顯著〔2〕。Dong等〔3〕研究認為，腦梗死后機體缺血區(qū)域神經(jīng)細胞也會緊跟著發(fā)生壞死，周圍神經(jīng)細胞表現(xiàn)為延遲性神經(jīng)元退變。Wnt信號通路屬于一種生長刺激信號通路，其啟動信號主要是Wnt蛋白，主要存在于腦組織、海馬區(qū)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用〔4〕。目前已經(jīng)有研究證實，Wnt3a蛋白參與脊髓發(fā)育過程〔5〕，在腦梗死中作用相關(guān)研究較少。本文旨在研究Wnt3a重組蛋白溶劑對腦梗死模型大鼠的干預(yù)效果及作用機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只清潔級SD雄性大鼠，體重240～320 g，均由河北伊維沃生物科技有限公司提供，許可證號：SYXK(冀)2019-008。均在室溫22℃、濕度50%環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。

1.2實驗方法

1.2.1腦梗死模型建立及分組 30只大鼠中選取10只為正常組，其余20只參考田烜〔6〕建立腦梗死模型，具體操作：采用4%的異氟烷將大鼠吸入麻醉后，保證其進行自主呼吸。選擇大鼠頸部正中切口，將右側(cè)的頸總、外、內(nèi)動脈分別分離后，將頸總、外動脈進行結(jié)扎，在近分叉位置做一“V”形切口，使用多聚賴氨酸、明膠等處理的1.8號魚線從切口位置向大鼠右頸內(nèi)動脈插入，深度為18.5 mm，一直到大鼠大腦中的動脈位置，將血供完全阻止。模型成功標準即大鼠右側(cè)出現(xiàn)霍納綜合征(Horner征)，成功18只，隨機分為模型組、Wnt3a溶劑組，各9只。

1.2.2藥物干預(yù) Wnt3a溶劑組大鼠給予50 ng/ml Wnt3a重組蛋白腹腔緩慢注射6 μl，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水進行干預(yù)。三組大鼠均連續(xù)干預(yù)1 w。

1.2.3氧化應(yīng)激、炎癥指標檢測 抽取大鼠腹部靜脈血3 ml,以3 000 r/min離心速度，離心處理10 min，分離上層血清。采用硫代巴比妥酸檢測丙二醛(MDA)水平；采用黃嘌呤氧化酶反應(yīng)檢測超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用比色法檢測谷胱甘肽(GSH)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β水平：將提前稀釋好的標準品100 μl加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37 ℃下處理90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準備好的抗體(0.1 ml)加入到每孔中，在37 ℃下處理60 min，底物中加四甲基聯(lián)苯胺(TMS)，空白孔中不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍色變?yōu)辄S色。在波長450 mm處分析TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4神經(jīng)功能統(tǒng)計 大鼠神經(jīng)功能采用Garcia評分〔7〕來完成，得分3～18分，12～18分表示大鼠有輕度神經(jīng)功能損傷；8～11分表示大鼠有中度神經(jīng)功能損傷；3～7分表示大鼠有重度神經(jīng)功能損傷。

1.2.5腦組織病理學(xué)觀察及腦梗死體積統(tǒng)計 處死大鼠，快速提取大鼠腦組織制作標本，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規(guī)石蠟切片，在濃度0.5%蘇木素-伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片。大鼠腦梗死體積=腦梗死面積×切片厚度。

1.2.6Wnt3a、β-catenin蛋白檢測 采用Western印跡檢測，將采集到的血液標本10 000 r/min離心處理10 min，對上清液進行提取后，BCA進行蛋白定量檢測，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(Wnt3a、β-catenin一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較 與正常組相比，模型組、Wnt3a溶劑組SOD、GSH水平降低，MDA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，Wnt3a溶劑組SOD、GSH水平升高，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較

2.2各組炎癥因子TNF-α、IL-1β水平比較 與正常組相比，模型組、Wnt3a溶劑組TNF-α、IL-1β水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，Wnt3a溶劑組TNF-α、IL-1β水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3各組腦梗死體積、神經(jīng)功能比較 與正常組相比，模型組、Wnt3a溶劑組神經(jīng)功能評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，Wnt3a溶劑組腦梗死體積減小、神經(jīng)功能評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 各組炎癥因子TNF-α、IL-1β水平比較

2.4各組腦組織病理學(xué)觀察 如圖1所示，正常組腦組織神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，無腫脹，細胞與血管之間排列緊密；模型組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)生腫脹，細胞與周圍血管之間的空隙增大；Wnt3a溶劑組大鼠腦組織水腫明顯減輕，神經(jīng)細胞數(shù)量增多。

表3 各組大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能比較

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE，×200)

2.5各組Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量比較 與正常組相比，模型組、Wnt3a溶劑組Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，Wnt3a溶劑組Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量比較

圖2 各組Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量比較

3 討 論

研究顯示，大部分腦梗死患者梗死灶主要分布在大腦半球中某一區(qū)域，其中大腦中動脈是常見的梗死部位〔8〕。郭安利等〔9〕研究認為，氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致缺血性腦血管疾病發(fā)病的主要原因。腦梗死發(fā)生會產(chǎn)生大量的氧自由基，氧化應(yīng)激反應(yīng)也隨之增加，通過對其進行誘導(dǎo)引起神經(jīng)毒性損傷，導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡〔10,11〕。SOD屬于一種特異性酶對氧自由基具有一定的清除作用，常被用來作為清除自由基的標志物〔12〕。MDA主要通過細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，是一種穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物；GSH與SOD結(jié)合在細胞抗氧化中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。本研究結(jié)果顯示，Wnt3a重組蛋白溶劑能抑制腦梗死模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而控制其疾病進一步發(fā)展。

Wnt信號通路參與多種器官及神經(jīng)系統(tǒng)形成、構(gòu)建過程，與神經(jīng)組織中神經(jīng)前體細胞的分化、增殖、遷移有緊密的聯(lián)系〔13〕。曾毅等〔14〕研究指出，在腦卒中發(fā)病后Wnt3a信號通路中相關(guān)蛋白β-catenin表達上調(diào)，提示通過抑制Wnt3a信號通路導(dǎo)致急性腦損傷患者病情加重。腦梗死發(fā)病與炎癥反應(yīng)有關(guān)，一旦發(fā)生腦缺血機體產(chǎn)生大量的炎癥反應(yīng)，氧自由基、興奮性氨基酸被大量釋放，放出有毒物質(zhì)，對腦組織帶來不可逆的損傷，神經(jīng)細胞大量凋亡，腦損傷嚴重程度較重〔15〕。TNF-α屬于一種重要的炎癥反應(yīng)因子，參與動脈粥樣硬化形成過程，加快腦神經(jīng)細胞凋亡速度。IL-1β能將內(nèi)皮細胞激活，血栓產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞間黏附分子表達異常，促進中性粒細胞向大腦組織浸潤，引起炎癥反應(yīng)，同時也是腦缺血損傷發(fā)病的主要病理原因〔16〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt3a重組蛋白溶劑能抑制腦梗死模型大鼠炎癥反應(yīng)發(fā)生，減少對腦組織帶來的損傷。在臨床腦梗死患者中，大腦中動脈阻塞發(fā)病率較高，其優(yōu)勢是不需要進行開顱，并且梗死部位較為恒定，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，這一模型的發(fā)病與患者臨床發(fā)病有相似之處〔17〕。本研究結(jié)果證實，Wnt3a重組蛋白溶劑能減少腦梗死模型大鼠腦梗死體積，提高神經(jīng)功能，促進其恢復(fù)。

Wnt3a蛋白與其他Wnt蛋白特點有相似之處，其特點主要體現(xiàn)在疏水性，以自分泌和旁分泌方式向細胞外進行釋放，可以結(jié)合細胞表面受體，將下游的信號相關(guān)通路激活〔18,19〕。Wnt3a信號蛋白在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化過程中發(fā)揮著重要作用，促進胚胎干細胞向脊髓背側(cè)中間神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，將Wnt信號通路激活后對神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生起到一定的抑制作用〔20,21〕。本研究中，Wnt3a重組蛋白溶劑能調(diào)控Wnt3a、β-catenin蛋白，將Wnt3a/β-catenin信號通路激活。本研究證實，Wnt3a/β-catenin信號通路激活會抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)相關(guān)指標，Wnt3a重組蛋白溶劑抑制腦梗死病情發(fā)展，促進神經(jīng)功能恢復(fù)與Wnt3a信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，Wnt3a重組蛋白溶劑對腦梗死模型大鼠干預(yù)效果顯著，能抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，減少腦梗死體積，提高神經(jīng)功能，其作用機制可能與Wnt3a/β-catenin信號通路有關(guān)，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。