外源性趨化因子CXC配體1促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性行為的作用機(jī)制

秦梓棋 程瑤 翁金如 湖連濤 李玥 王偉群

(佳木斯大學(xué) 1檢驗醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2口腔醫(yī)學(xué)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肝癌包括肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌(ICC)和其他罕見腫瘤，其中最主要的是纖維狀層狀癌和肝母細(xì)胞瘤〔1,2〕。研究顯示，2018年肝癌的新發(fā)病例為841 000例，病死高達(dá)782 000例〔3〕。流行病學(xué)研究表明，肝癌發(fā)生有明顯地域差異，北歐和北美地區(qū)發(fā)病率較低，而亞太地區(qū)則高發(fā)〔4〕。中國已經(jīng)成為肝癌的重災(zāi)區(qū)，有超過50%肝癌患者來自于中國〔5〕。目前認(rèn)為，許多危險因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精攝入、肝病史和吸煙等已被證實與肝癌發(fā)生率升高具有顯著相關(guān)性〔6〕。據(jù)統(tǒng)計，在病毒相關(guān)性肝癌中，75%～80%的肝癌發(fā)生與HBV感染有關(guān)，10%～20%與HCV感染有關(guān)，這表明炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答在肝癌發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要作用〔7〕。

趨化因子是由細(xì)胞分泌的一類蛋白信號分子，因其具有誘導(dǎo)反應(yīng)細(xì)胞做定向移動和趨化的能力，故名趨化因子。根據(jù)位于氨基端兩個保守半胱氨酸殘基的排列方式不同，趨化因子可分為CXC、CC、C和 CX3C四個亞家族〔8〕。在CXC亞家族中，又根據(jù)功能區(qū)第一個半胱氨酸前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)氨基酸結(jié)構(gòu)，把其分為ELR+CXC和ELR-CXC〔9〕。趨化因子的功能實施主要是由G蛋白耦聯(lián)7次跨膜趨化因子受體介導(dǎo)的，趨化因子與其受體間存在復(fù)雜的對應(yīng)關(guān)系，1個受體可以結(jié)合多個配體，如CXCR1可結(jié)合CXCL6和CXCL8；反之，1個配體也可有多個受體，如CXCL6的受體有CXCR1和CXCR2，這種混亂的對應(yīng)關(guān)系構(gòu)成了趨化因子間復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)〔10〕。此外，趨化因子也可結(jié)合非G蛋白耦聯(lián)7次跨膜受體的非典型趨化因子受體(ACKR)，該受體雖然不能介導(dǎo)常規(guī)趨化因子受體的信號通路，但可經(jīng)清除趨化因子而調(diào)控趨化因子在組織中的濃度。迄今為止，人們已識別出近50種趨化因子，它們可分別經(jīng)20種G蛋白耦聯(lián)趨化因子受體和4種ACKR發(fā)揮生物學(xué)功能〔11〕。

趨化因子的主要生理功能是在炎癥及免疫應(yīng)答中調(diào)控和誘導(dǎo)多種粒細(xì)胞的激活、趨化及遷移。此外，趨化因子還被認(rèn)為在淋巴組織的發(fā)育、免疫細(xì)胞的成熟及適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和傳遞過程中發(fā)揮重要作用。趨化因子及其受體的表達(dá)失調(diào)可涉及許多人類疾病，其中包括自身免疫性疾病、炎癥性疾病和惡性腫瘤〔11〕。炎性細(xì)胞浸潤幾乎是所有惡性腫瘤的基本特征之一，而趨化因子在引導(dǎo)炎性細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境內(nèi)積累起著關(guān)鍵作用。慢性炎癥易導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展，原因之一是由趨化因子吸引來的炎性細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中可提供促進(jìn)腫瘤發(fā)展的生長因子和血管生成因子〔12〕。但越來越多的證據(jù)也表明趨化因子對表達(dá)趨化因子受體的腫瘤細(xì)胞具有直接作用。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及趨化來的炎性細(xì)胞等均可釋放多種趨化因子，細(xì)胞間可經(jīng)自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的血管發(fā)生〔12〕。本研究探討外源性CXCL1對肝癌細(xì)胞惡性行為的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞、材料及儀器RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和Transwell小室(美國Corning公司)，BEL-7402肝癌細(xì)胞(美國模式菌種收集中心)，重組人CXCL1(美國PeproTech公司)，兔抗BCL-2多克隆抗體(中國Affinity公司)，鼠抗AKT單克隆抗體和鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(中國Abways公司)，細(xì)胞計數(shù)試劑(CCK)-8和二辛喹酸(BCA)蛋白定量試劑盒(中國武漢博士德生物公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(美國Corning公司)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Milipore公司)，辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)二抗(中國北京中杉金橋公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(美國Thermo公司)，放射性免疫沉淀法分析(RIPA)蛋白裂解液(上海碧云天生物公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(北京索萊寶公司)，圖像采集及分析系統(tǒng)、EPS300電泳儀、蛋白電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽(上海天能公司)，全自動多功能酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Beckman公司)。

1.2細(xì)胞增殖實驗 將BEL-7402肝癌細(xì)胞按2×103個/孔接種到96孔板各孔中；將孔板中的細(xì)胞分為3組，每組10孔，各組所用的培養(yǎng)基分別為含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基；將細(xì)胞置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；向各孔中分別吸入10 μl CCK-8試劑，然后在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；將孔板置于酶標(biāo)儀中讀取450 nm波長的光密度值。

1.3細(xì)胞遷移實驗 將BEL-7402肝癌細(xì)胞按1×104個/孔接種到Transwell上室各孔中；將孔板中的細(xì)胞分為3組，每組4室；各組上室中的培養(yǎng)基分別為含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，而下室均為含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基；將細(xì)胞置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用脫脂棉簽擦拭小室上表面以去除未遷移細(xì)胞；利用甲醇結(jié)晶紫染色后，自來水沖洗、晾干，在倒置微鏡下拍照并計算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.4Western印跡實驗 將BEL-7402肝癌細(xì)胞按1×106個/孔接種到6孔板各孔中；將孔板中的細(xì)胞分為3組，各組所用的培養(yǎng)基分別為含0、5、10 ng/ml外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基；將細(xì)胞置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；胰蛋白酶消化細(xì)胞后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；低速離心機(jī)中離心5 min(800 r/min)以收集細(xì)胞沉淀；向細(xì)胞沉淀中加入200 μl RIPA蛋白裂解液和2 μl PMSF，劇烈吹打以保證細(xì)胞完全裂解；將離心管置于4℃高速冷凍離心機(jī)中離心20 min(15 000 r/min)；將上層液體移入新的離心管中，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量；吸取40 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用5%脫脂奶對膜封閉60 min；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)洗滌3次×5 min，將膜在4℃冰箱中分別用Bcl-2(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗孵育過夜；PBS-T洗滌3次×5 min，將膜在37℃中用HRP耦聯(lián)二抗(1∶10 000)孵育30 min；PBS-T洗滌4次×8 min；將膜用ECL試劑孵育并置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影和拍照。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1外源性CXCL1促進(jìn)BEL-7402肝癌細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，CCK-8增殖實驗顯示，0、5和10 ng/ml 外源性CXCL1處理組的光密度值分別為(0.71±0.11)、(0.82±0.12)、(1.24±0.36)。與0 ng/ml處理組比較，5、10 ng/ml處理組顯著增高(P=0.000 4；P=0.000 0)，說明外源性CXCL1可顯著促進(jìn)BEL-7402肝癌細(xì)胞的增殖能力。

2.2外源性CXCL1促進(jìn)BEL-7402肝癌細(xì)胞遷移 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Transwell遷移實驗顯示，0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為(104.75±15.92)個、(111.50±6.86)個、(248.00±53.17)個。與0 ng/ml處理組比較，10 ng/ml處理組顯著增高(P=0.002 1)，說明外源性CXCL1可顯著促進(jìn)BEL-7402肝癌細(xì)胞的遷移能力。

2.3外源性CXCL1上調(diào)BEL-7402肝癌細(xì)胞Bcl-2和AKT蛋白表達(dá) 0、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組細(xì)胞的Bcl-2相對表達(dá)量分別是(0.32±0.11)和(1.35±0.21)，兩者差異顯著(P=0.001 5)；0、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組細(xì)胞的AKT相對表達(dá)量分別是(0.94±0.11)和(2.89±0.40)，兩者差異顯著(P=0.001 2)。見圖1。

圖1 外源性CXCL1上調(diào)BEL-7402肝癌細(xì)胞Bcl-2和AKT蛋白表達(dá)

3 討 論

趨化因子是一類分子量為8～12 kD的細(xì)胞因子超家族成員，具有廣泛的生物學(xué)作用，在免疫細(xì)胞和骨髓造血細(xì)胞的生成、分化、發(fā)育及免疫應(yīng)答的調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用，還參與炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病的病理生理過程〔13〕。

目前認(rèn)為，趨化因子可經(jīng)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及存活。如趨化因子可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路，調(diào)控生長相關(guān)基因如細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1〔14〕、即刻早期反應(yīng)因子(Egr)-1〔15〕、原癌基因(Fos)〔16〕、肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)〔17〕基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，趨化因子也可通過影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來打破凋亡/抗凋亡之間的平衡，從而實現(xiàn)其促增殖活性，如上調(diào)p53結(jié)合蛋白同源物(Mdm2)〔18〕和Bcl-2〔19〕基因的表達(dá)，下調(diào)半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-7和腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF)10C基因的表達(dá)〔20〕。所有實體腫瘤都需要血管系統(tǒng)來提供營養(yǎng)，如果沒有新生血管的形成，腫瘤在缺少血供的情況下既不能迅速增大，也不能向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在趨化因子家族中，CXC類趨化因子對血管具有重要的調(diào)控作用，它們可經(jīng)MAPK/ERK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT和Wnt/β-連環(huán)蛋白(Catenin)等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響腫瘤的血管生成〔21,22〕。通常情況下，ELR+CXC 類趨化因子(如CXCL1、CXCL3、CXCL5和CXCL8等)可通過表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞上的CXCR2受體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致血管生成。而ELR-CXC類趨化因子(如CXCL4、CXCL9和CXCL10等)則可經(jīng)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的趨向性而抑制血管生成〔23〕。趨化因子及其受體在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中亦發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，如Itatani等〔24〕發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中多種趨化因子/受體軸如CXCL1/CXCR2、CXCL9/10/CXCR3、CXCL12/CXCR4、CCL2/CCR2、CCL5/CCR5和CCL15/CCR1等均可參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移活性。

CXCL1又名GRO-α，屬于ELR+CXC類趨化因子，其主要通過與其細(xì)胞膜上特異性受體CXCR2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明，CXCL1在許多人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)上調(diào)與腫瘤的高臨床分期、分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和總體生存期具有顯著相關(guān)性〔25〕。功能研究顯示，腫瘤細(xì)胞分泌的高水平CXCL1可引導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)趨化至腫瘤微環(huán)境中，而來源于腫瘤細(xì)胞、TAM和CAF的CXCL1可經(jīng)自分泌的旁分泌途徑促進(jìn)腫瘤的增殖活性〔26〕。Payne等〔27〕報道CXCL1、CXCL2和CXCL3等趨化因子對黑色素瘤細(xì)胞的生長有直接促進(jìn)作用，在體外應(yīng)用特異性抗體阻斷CXCL1 或其受體CXCR2，黑色素瘤細(xì)胞生長受到抑制。

Yang等〔28〕研究表明，肝癌細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCL5及其受體CXCR2，當(dāng)外源性給予或過表達(dá)CXCL5可經(jīng)旁分泌及自分泌途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。既然CXCL1與CXCL5共享同一受體CXCR2，提示CXCR2介導(dǎo)的信號通路參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程，可能部分是通過其另一配體CXCL1發(fā)揮作用的。本文結(jié)果表明，不同濃度的外源性CXCL1可分別促進(jìn)BEL-7402肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，外源性CXCL1還可上調(diào)BEL-7402肝癌細(xì)胞Bcl-2和AKT蛋白的表達(dá)。作為一種重要的凋亡相關(guān)基因，Bcl-2可通過抑制細(xì)胞凋亡途徑，來促進(jìn)細(xì)胞存活和細(xì)胞分裂，因此在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔29〕。PI3K/AKT是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在多種人類腫瘤中，該通路的異常激活可參與和調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及代謝等過程〔30〕。研究表明AKT 亦可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，這與其磷酸化下游凋亡相關(guān)分子如 Bcl-2、caspase家族成員有關(guān)〔30〕。

綜上，外源性CXCL1可經(jīng)活化Bcl-2/AKT抗凋亡途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)程。