緊密連接對(duì)肺通透性影響的研究進(jìn)展

武 勰，晏馥霞

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院 麻醉中心，北京 100037)

肺通透性受損是各種類(lèi)型肺損傷的一個(gè)重要的病理改變，此時(shí)大量富含蛋白的水腫液滲出，引起肺水腫和低氧血癥，在胸片上表現(xiàn)為不同程度的肺部浸潤(rùn)。肺正常通透性的維持依靠細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間緊密連接(tight junctions，TJs)以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附的動(dòng)態(tài)調(diào)控，是細(xì)胞內(nèi)外多種效應(yīng)分子關(guān)聯(lián)的結(jié)果，其中TJs是相鄰內(nèi)皮細(xì)胞彼此連接成細(xì)胞單層的重要組成部分。TJs位于相鄰細(xì)胞之間直接接觸的部位，它們共同作用來(lái)調(diào)控血管內(nèi)皮和肺泡上皮的通透性。因此，本文就TJs對(duì)肺通透性影響的相關(guān)研究做一簡(jiǎn)要綜述。

1 肺的通透性

肺泡是氣體交換的場(chǎng)所，從肺泡到血管至少需要通過(guò)兩層細(xì)胞，即肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮，并構(gòu)成肺泡-毛細(xì)血管屏障。在正常肺組織中，液體和少量蛋白質(zhì)會(huì)通過(guò)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的小間隙從血管內(nèi)傳遞至組織間隙，然后再由淋巴管回流到全身循環(huán)。由于肺泡上皮的緊密性，液體和溶質(zhì)在正常情況下不會(huì)進(jìn)入肺泡。但當(dāng)肺泡上皮和肺微血管內(nèi)皮屏障受損時(shí)，液體及蛋白質(zhì)等則會(huì)從血管轉(zhuǎn)移至肺間質(zhì)繼而進(jìn)入肺泡造成肺水腫，因此有人把血管內(nèi)皮屏障稱(chēng)為阻止肺水腫形成的第一屏障, 而把肺泡上皮屏障稱(chēng)為第二屏障。無(wú)論是肺血管內(nèi)皮屏障或是肺泡上皮屏障，都是影響肺通透性改變的關(guān)鍵因素。

1.1 肺血管內(nèi)皮屏障

肺血管內(nèi)皮屏障主要由肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞匯合而成，對(duì)于肺組織的通透性至關(guān)重要，其主要功能有以下兩點(diǎn)，一方面它需要最大程度的減少血漿蛋白和血細(xì)胞向肺間質(zhì)的滲漏，從而防止在正常血管壓力下出現(xiàn)威脅生命的肺泡充血；此外，還需要通過(guò)內(nèi)皮屏障來(lái)進(jìn)行液體、電解質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。內(nèi)皮細(xì)胞是微血管壁內(nèi)液體和溶質(zhì)通過(guò)的主要屏障，物質(zhì)交換的主要途徑有兩種：細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。通常認(rèn)為液體和大多數(shù)溶質(zhì)通過(guò)肺微血管壁采取細(xì)胞旁途徑，相對(duì)較大的溶質(zhì)(如大分子等)的運(yùn)輸途徑則存在爭(zhēng)議，尤其是在炎性反應(yīng)出現(xiàn)的情況下，更有可能是通過(guò)跨細(xì)胞途徑。所有鄰近的血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此緊密相連形成血管內(nèi)皮屏障，并維持了正常肺組織中較低的細(xì)胞旁通透性。沒(méi)有完整的內(nèi)皮屏障，肺就不能維持肺泡氣體和毛細(xì)血管血液的嚴(yán)格分離，而這是正常氣體交換所必需的[1]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞間連接的穩(wěn)定性和強(qiáng)度變得非常重要。屏障的穩(wěn)定性與內(nèi)皮細(xì)胞間黏附、內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的牢固附著以及內(nèi)皮細(xì)胞的形狀等都密切相關(guān)，而所有這些都離不開(kāi)細(xì)胞的TJs。

1.2 肺泡上皮屏障

肺泡上皮屏障主要由肺泡上皮細(xì)胞組成，其主要功能是將充滿氣體的肺泡腔與肺間質(zhì)液體隔開(kāi)，此外，肺泡上皮還要參與不同腔隙之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)換[2]。健康的肺泡中，肺泡上皮是一個(gè)極其緊密的屏障，會(huì)限制水、電解質(zhì)及親水性的小溶質(zhì)進(jìn)入到肺泡腔。當(dāng)心源性功能障礙或容量超負(fù)荷等導(dǎo)致肺水腫時(shí)，水腫液會(huì)在肺泡腔中聚集，此時(shí)機(jī)體會(huì)通過(guò)頂膜上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)主動(dòng)運(yùn)輸鈉離子，形成跨上皮滲透梯度，使水腫液被動(dòng)地從肺泡腔移向肺間質(zhì)，從而清除多余液體。肺泡上皮損傷是促進(jìn)肺通透性增加的關(guān)鍵因素。肺泡上皮損傷的潛在機(jī)制包括細(xì)胞死亡/凋亡、細(xì)胞間TJs的受損、細(xì)胞外基質(zhì)成分及其與上皮細(xì)胞間接觸的變化，以及上皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞間的相互作用等，這些因素都可以通過(guò)機(jī)械拉伸、炎性反應(yīng)失調(diào)、白細(xì)胞和血小板的過(guò)分激活以及微血栓形成時(shí)促凝信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)加重肺損傷的程度[3]。其中，影響肺通透性和肺泡清除能力的最主要因素則是TJs的受損。

2 緊密連接

TJs是細(xì)胞黏附的重要組成部分，對(duì)于肺通透性的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用。TJs是黏附在相鄰細(xì)胞脂質(zhì)膜上的蛋白復(fù)合物，在上皮細(xì)胞間與內(nèi)皮細(xì)胞間均存在，主要具有柵欄和屏障功能。TJs阻止細(xì)胞膜中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等的自由流動(dòng)，將內(nèi)皮和上皮細(xì)胞膜劃分成基底膜和頂膜兩部分，參與維持細(xì)胞極性，完成柵欄功能；通過(guò)調(diào)控水、電解質(zhì)及小分子溶質(zhì)的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)完成屏障功能。TJs主要包括跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白：跨膜蛋白包括閉合蛋白家族(occludin)、密封蛋白家族(claudin)和連接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等，其主要通過(guò)在細(xì)胞外環(huán)相互融合，使細(xì)胞間形成緊密連接；胞質(zhì)蛋白包含ZO蛋白家族和cingulin，它會(huì)和細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白連接并最終與骨架蛋白中的肌動(dòng)蛋白(F-actin)結(jié)合形成緊密連接網(wǎng)絡(luò)，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞頂端及基底外側(cè)區(qū)域防止溶質(zhì)自由出入(圖1)。

圖1 緊密連接結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Diagram of tight junctions

2.1 跨膜蛋白

2.1.1 閉合蛋白：閉合蛋白是TJs中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)蛋白。其分子質(zhì)量為65 ku，有兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)和兩個(gè)剪接變異，是首個(gè)被認(rèn)為與TJs形成和肺通透性有關(guān)的蛋白，也是維持肺泡上皮屏障的重要組成部分。閉合蛋白胞外結(jié)構(gòu)域?qū)⑵渑c其他TJs連接，并在一定程度上影響肺的緊密連接和肺的通透性[4]。有研究表明，機(jī)械通氣引起的急性肺水腫肺損傷是由于閉合蛋白表達(dá)降低、TJs的降解、肺泡屏障完整性破壞以及肺泡上皮通透性增加所致，并且可以通過(guò)上調(diào)閉合蛋白減少機(jī)械通氣所致肺損傷。然而，缺乏閉合蛋白的胚胎干細(xì)胞能夠形成緊密連接結(jié)構(gòu)；細(xì)胞模型中敲低閉合蛋白不會(huì)影響跨上皮電阻，并且在內(nèi)皮細(xì)胞中不會(huì)產(chǎn)生通透性表型；在小鼠模型中敲除閉合蛋白也沒(méi)有影響細(xì)胞旁通透性，這表明閉合蛋白不是形成TJs所必需的成分，它的缺失可以由其他蛋白代償[5]。

2.1.2 密封蛋白家族：密封蛋白是一個(gè)由27個(gè)跨膜蛋白組成的家族，是緊密連接屏障中調(diào)節(jié)溶質(zhì)在極化上皮細(xì)胞間移動(dòng)的關(guān)鍵部分。密封蛋白家族成員彼此相互作用，也與其他跨膜緊密連接蛋白(如閉合蛋白)和胞質(zhì)支架蛋白(如Zonula occluden 1，ZO-1)相互作用。盡管所有種類(lèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)于TJs的形成和功能都很重要，但密封蛋白家族蛋白質(zhì)直接參與形成具有特定滲透性的細(xì)胞旁離子的選擇性通道，因此在參與屏障功能的眾多蛋白中最為重要[6]。密封蛋白是由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)胞外環(huán)、一個(gè)短的胞質(zhì)N端和一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)C端組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為20～27 ku。根據(jù)密封蛋白的功能不同可將其分為兩個(gè)亞類(lèi):1)通過(guò)形成細(xì)胞旁通道而增加細(xì)胞旁通透性的密封蛋白;2)降低細(xì)胞旁通透性的密封蛋白。前者包括密封蛋白-2、-7、-10、-15、-16等，而后者研究較多的有密封蛋白-1、-3、-5、-11、-19等[7]。密封蛋白的表達(dá)在不同組織中會(huì)差異表達(dá)，在肺中傾向于降低細(xì)胞旁通透性，已知研究中明確在肺部表達(dá)的有密封蛋白-1、-3、-4、-5、-7和-18[8]。

密封蛋白-1可以調(diào)節(jié)相鄰的上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞黏附，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，當(dāng)密封蛋白-1表達(dá)量降低時(shí)TER降低，肺通透性也隨之升高；此外，有研究敲除小鼠的密封蛋白-1基因，發(fā)現(xiàn)小鼠會(huì)死于嚴(yán)重的屏障損害[9]。密封蛋白-3在其他組織中的研究表明它可降低細(xì)胞旁通透性，但在肺泡上皮細(xì)胞中卻發(fā)現(xiàn)其會(huì)使細(xì)胞旁通透性增加，同時(shí)會(huì)降低密封蛋白-4的密封作用[10]。人類(lèi)和小鼠的肺中，密封蛋白-4的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺泡清除率增高，這提示密封蛋白-4具有肺保護(hù)或促進(jìn)肺修復(fù)作用，這可能是因?yàn)槊芊獾鞍?4形成了限制鈉電導(dǎo)的高阻連接，導(dǎo)致了更大的跨上皮鈉梯度[11]。密封蛋白-5是內(nèi)皮細(xì)胞TJs中主要的跨膜蛋白，但敲除該基因并未在肺血管中產(chǎn)生通透性表型；健康肺泡上皮中密封蛋白-5表達(dá)量較低，且肺上皮細(xì)胞旁通透性會(huì)隨密封蛋白-5表達(dá)的增加而增加[8]。密封蛋白-7在不同細(xì)胞中對(duì)緊密連接的作用不盡相同。小鼠敲除密封蛋白-7會(huì)損傷腎臟重吸收能力并導(dǎo)致慢性脫水，這表明密封蛋白-7在跨上皮離子運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用，但目前為止尚未發(fā)現(xiàn)敲除后會(huì)出現(xiàn)肺部表型[12]。密封蛋白-18是唯一已知的肺特異性TJs，并且是1型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)最豐富的密封蛋白，它在肺泡上皮細(xì)胞中提供了一個(gè)大分子的通透性屏障，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)密封蛋白-18缺失時(shí)會(huì)導(dǎo)致肺泡內(nèi)環(huán)境的紊亂并使肺泡受損，但密封蛋白-18 敲除的小鼠并沒(méi)有發(fā)展成肺水腫，這可能與動(dòng)物模型中Na+/K+-ATP酶的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致較高的肺泡清除能力有關(guān)，但也有報(bào)道敲除密封蛋白-18后小鼠會(huì)出現(xiàn)肺癌表型[13-14]。

2.2 胞質(zhì)蛋白

胞質(zhì)蛋白有閉鎖小帶蛋白(如ZO家族)和扣帶蛋白(cingulin)等，在緊密連接中主要起到防止溶質(zhì)在細(xì)胞頂端和基底外側(cè)自由出入的作用。在肺通透性中研究最多的是ZO家族中的ZO-1。ZO-1相對(duì)分子質(zhì)量為210 ～ 225 ku，有1個(gè)長(zhǎng)的羧基末尾區(qū)域和富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的酸性模塊，幾個(gè)選擇性剪接點(diǎn)。在緊密連接網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成中，ZO-1主要是通過(guò)與其同源體的ZO-2和ZO-3相結(jié)合，為跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白搭建具備銜接作用的“腳手架樣平臺(tái)”。

ZO-1作為一種支架蛋白，連接TJs中跨膜蛋白與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，是影響肺部屏障結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的兩種主要成分，它們相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的張力和收縮，這也會(huì)影響上皮的通透性。這些蛋白在緊密連接復(fù)合物中的表達(dá)、定位和組裝以及它們與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白纖維的相互作用的改變會(huì)導(dǎo)致緊密連接的功能障礙，從而增加細(xì)胞旁通透性，因此常以ZO-1作為評(píng)價(jià)細(xì)胞間屏障功能的主要指標(biāo)[15]。此外，ZO-1還通過(guò)招募刺激物質(zhì)來(lái)刺激肌動(dòng)蛋白聚合，構(gòu)建皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白環(huán)，并通過(guò)與皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白環(huán)的結(jié)合，增強(qiáng)TJs的穩(wěn)定性，減少肺的通透性[16]。

3 前景與展望

目前，急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的治療措施主要包括治療原發(fā)病、呼吸支持治療、液體管理以及糖皮質(zhì)激素等。針對(duì)性的通過(guò)調(diào)節(jié)TJs來(lái)改善肺通透性，從而從根本上治療ALI，是未來(lái)可能的一個(gè)治療方向。有動(dòng)物研究表明，去乙?；?1(SIRT-1)通過(guò)上調(diào)多種TJs的表達(dá)來(lái)減少肺血管內(nèi)皮的滲漏，從而減輕ALI程度[17]；異氟烷通過(guò)抑制ALI時(shí)ZO-1的降低改善肺泡毛細(xì)血管屏障，減少呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的發(fā)生[18]；烏司他丁也可以通過(guò)保護(hù)TJs來(lái)減少膿毒癥時(shí)肺微血管內(nèi)皮的通透性，從而減輕ALI[19]。

總之，肺通透性改變是肺損傷時(shí)重要的病理改變之一。通過(guò)改變TJs來(lái)調(diào)控肺的通透性，從而減輕患者的肺損傷，則為肺損傷的治療提供了一個(gè)新的思路。闡述TJs在肺通透性的影響將有助于對(duì)這一問(wèn)題的深入理解，相信隨著研究的不斷深入，通過(guò)加強(qiáng)TJs來(lái)改善肺的通透性將有望成為肺損傷治療的重要舉措之一。