關(guān)于單核細胞增生李斯特菌毒力因子、致病機理和毒力檢測技術(shù)的綜述

◎ 陶 飛，林 慧，顏春榮，徐春祥

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210000）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的食源性人畜共患病原菌，廣泛存在于土壤、植物、污水中，易造成對肉制品、海產(chǎn)品、牛奶蔬菜的污染。該菌是兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，耐低溫（-1.5～45 ℃可生長，-20 ℃下可以存活1年）、耐高鹽、可以形成生物膜，對環(huán)境的適應(yīng)能力很強，可以存在于食品的原料、加工、運輸、冷藏過程中[1-2]，因此檢測和控制食品中的單核細胞增生李斯特菌比較困難。LM易感染孕婦、老人、嬰兒等免疫力低下的人群。感染后的主要癥狀較輕為胃腸炎，較重為腦膜炎、敗血癥、壞死性肝炎等[3]。由LM引起的食源性疾病發(fā)病率不高，死亡率卻高達20%～30%[2]。

食源性單核細胞增生李斯特菌來源不同，毒力和致病性也不同，為單核細胞增生李斯特菌的檢測及控制帶來了困難，因而分析單核細胞增生李斯特菌的毒力和致病性規(guī)律，對更好的檢測和控制單核細胞增生李斯特菌有重要的指導意義。本文將從4方面對其主要毒力因子展開綜述，分別為與環(huán)境抗逆相關(guān)的毒力因子、與黏附侵襲相關(guān)的毒力因子、與胞內(nèi)感染相關(guān)毒力因子以及毒力調(diào)控因子。接著從毒力因子致病的機理綜述了單核細胞增生李斯特菌致病的過程，最后對國內(nèi)外單核細胞增生李斯特菌毒力檢測方法進行介紹。

1 單核細胞增生李斯特菌的關(guān)鍵毒力因子

1.1 與環(huán)境抗逆相關(guān)的毒力因子

細菌進入宿主的消化道后，要承受胃酸環(huán)境和膽酸鹽、非特異性炎性因子和蛋白水解酶的破壞作用。膽酸鹽水解酶（BSH）可以分解已經(jīng)結(jié)合的膽酸鹽，保護細菌不會受到膽酸鹽的殺傷作用。BSH由bsh基因編碼，受到轉(zhuǎn)錄活化因子prfA的正向調(diào)節(jié)，也受Sigma B因子的控制[4-5]。一些應(yīng)激應(yīng)答因子比如Lmo1421、OpuCA等則被發(fā)現(xiàn)是通過各自的途徑保證細菌在消化道內(nèi)能夠存活。也有一些與滲透壓耐受相關(guān)的因子可以產(chǎn)生幾種滲透物攝取系統(tǒng)，如甜菜堿轉(zhuǎn)運子BetL和Gbu、肉堿轉(zhuǎn)運子OpuC[6]。

1.2 與黏附侵襲相關(guān)的毒力因子

細菌通過與黏附和侵襲相關(guān)的毒力因子入侵細胞。內(nèi)化素是一類與黏附侵襲相關(guān)性很大的毒力因子，它能夠識別宿主細胞上的受體，從而完成細菌對靶細胞的內(nèi)化入侵[7]。除了內(nèi)化素，溶血素LLO（hly）、細胞壁水解酶（P60）、酰胺酶（Ami）、纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FbpA）、肌動蛋白聚集因子（ActA）和自溶素（auto）等毒力因子都協(xié)同參與了細菌的黏附和侵襲[8-9]。此外，MANDIN等人發(fā)現(xiàn)dlt操縱子也是一種與黏附和侵襲相關(guān)的毒力因子，當缺失該操縱子時，細菌的黏附侵襲能力明顯降低[10]。

1.3 細胞內(nèi)感染相關(guān)毒力因子

單核細胞增生李斯特菌在真核細胞內(nèi)的感染周期與多個因素相關(guān)，包括它在細胞內(nèi)的生存、增殖能力及在細胞間的擴散能力。在溶血素（LLO）和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶（PlcA）的裂解作用下，LM可以從吞噬小體逃離進入細胞質(zhì)中，在己糖磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（Hpt）的作用下，利用細胞質(zhì)中的營養(yǎng)成分進行增殖[11]。還可以借助肌動蛋白聚集因子（ActA）實現(xiàn)細菌在細胞內(nèi)和細胞間的擴散，其中磷脂酰肌醇特異性卵磷脂酶（PlcB）和LLO介導細胞膜的裂解。細菌被臨近的細胞吞噬后，便又開始了新一輪的感染[11-12]。

1.4 毒力調(diào)控因子

單核細胞增生李斯特菌的大多數(shù)重要毒力基因都受轉(zhuǎn)錄活化因子PrfA調(diào)控。在染色體一個9kb區(qū)域上存在一個LIP-1毒力島，由于LIPI-1毒力島上基因的表達全部受PrfA調(diào)控，因此該毒力島又稱PrfA依賴型毒力基因簇。第二毒力島LIPI-2又稱內(nèi)化素島，其絕大部分內(nèi)化素基因也都受PrfA的調(diào)控[9]。而應(yīng)答調(diào)控因子VirR是僅次于PrfA的第二大毒力調(diào)控因子，調(diào)控了12個毒力基因，分別是mprF、dltA、dltB、dltC、dltD、LMo2114和LMo2115等[13]。其 編 碼 基因缺失后，LM對小鼠的毒力降低，同時對培養(yǎng)細胞Caco-2的侵襲力也顯著降低[14]。此外Sigma B是對環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)控因子，在極端pH、高滲透壓、低溫、氧化和葡萄糖限制的條件下，sigma B被激發(fā)，從而生成100多種抗逆蛋白質(zhì)[15]。

2 單核細胞增生李斯特菌的致病機理

2.1 單核細胞增生李斯特菌在宿主體內(nèi)的感染

食源性的LM可以隨污染的食物經(jīng)口腔進宿主的消化道，大部分細菌被胃酸殺死，只有一小部分細菌能夠進入腸道系統(tǒng)，并在腸道內(nèi)增殖，其中有一部分通過糞便直接排出體外，并且再次污染食物、水源以及飼料等，形成一個完整的糞口傳播途徑[16]。

未排出體外的LM可以很快的穿過腸道上皮細胞屏障進入機體的腸道深層，該過程不會對腸道上皮造成損傷，通過M細胞進入腸道深層后，再通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)被轉(zhuǎn)移到肝臟[17]。LM能穿過血腦屏障引起腦膜炎等神經(jīng)癥狀，還可以穿越胎盤屏障，造成流產(chǎn)或新生兒溶血[18-19]。

2.2 單核細胞增生李斯特菌在細胞間的感染

LM在細胞間的感染過程及其致病過程分為3個階段。

（1）LM被吞噬細胞吞噬，在內(nèi)化素A（InlA）、內(nèi)化素B（InlB）、P60蛋白等黏附分子的作用下與黏附蛋白受體結(jié)合，黏附于細胞上。一旦LM黏附到細胞表面之后，就可以通過拉鏈機制進入宿主細胞（“拉鏈式”是指細菌表面配體與宿主細胞膜受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號通路，造成肌動蛋白骨架重排引發(fā)細胞膜對菌體的漸進包裹吞噬，而不是肌動蛋白骨架大規(guī)模重組）[9,20]。酰胺酶（Ami）和肌動蛋白聚合蛋白（ActA）等協(xié)同參與細菌的黏附侵襲，這一過程是細胞間感染的前提。

（2）LM在磷脂酶A（PlcA）、磷脂酶B（PlcB）和溶血素（LLO）的協(xié)同作用下裂解吞噬體膜。進入細胞質(zhì)后，細菌在LM己糖磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（Hpt）的作用下攝取養(yǎng)分存活增殖[21]?，F(xiàn)階段LM逃離吞噬小體機制的相關(guān)研究還不太完善，目前主要有兩個有共通之處的理論可以解釋這個機制。①第一種理論認為LLO可以介導磷脂酶C的亞細胞定位發(fā)生變化，從而接觸到位于內(nèi)膜上的底物磷脂使其發(fā)生降解[12]。②第二種理論認為發(fā)育成熟的吞噬小體長時間暴露在胞漿中可以被溶酶體溶解，而LLO可以通過在發(fā)育后期的吞噬小體上打孔以延遲其成熟，從而使Plc有充足的時間將吞噬體膜裂解，用RNA干擾的方式阻礙宿主細胞中參與內(nèi)吞小體和溶酶體融合的蛋白的表達，使得缺失LLO的LM逃離吞噬小體[22]。

（3）LM在肌動蛋白聚合蛋白（ActA）的輔助下在細胞內(nèi)運動，并伸出偽足向鄰近的細胞擴散，使細菌在宿主細胞間傳播。具有運動能力的LM移動至細胞膜，可以在膜上形成突起，伸向另一個細胞，再被臨近的細胞吞噬，這一過程不會造成細胞裂解，這樣LM就可以不用暴露在胞外環(huán)境中。LM在另一個細胞內(nèi)形成有兩層膜包裹的次級吞噬小體，最終再次通過LLO、PLC等的膜裂解作用逸入宿主細胞質(zhì)中，并開始新的細胞內(nèi)感染周期[21]?，F(xiàn)在仍然不清楚細菌是否可以區(qū)分初級吞噬小體和次級吞噬小體從而對毒力基因的表達作出相應(yīng)的調(diào)整，但是可以確定PLC在LM逃離次級吞噬小體機制中有著更為重要的作用。

3 單核細胞增生李斯特菌毒力檢測技術(shù)

目前，單核細胞增生李斯特菌毒力檢測主要包括體內(nèi)毒力實驗、體外細胞實驗、基因水平檢測和蛋白水平檢測。小鼠毒力實驗為體內(nèi)檢測細菌致病力的方法，但實驗成本高，且耗時。體外培養(yǎng)細胞實驗相對于小鼠毒力實驗成本較低，且操作簡便，雖然具有重要的細菌毒力預(yù)測價值但相對費時。隨著單核細胞增生李斯特氏菌及無害李斯特氏菌全基因組序列的測定技術(shù)的發(fā)展，己鑒定出若干新的毒力相關(guān)基因，使通過毒力基因檢測單核細胞增生李斯特菌的致病力的目標得以實現(xiàn)。

3.1 體內(nèi)毒力實驗

體內(nèi)毒力實驗是用動物實驗來評估微生物毒力和致病性。小鼠是最早和最適合作毒理試驗的動物，但其他動物比如豚鼠、兔子和靈長類動物也有被用于測試單核細胞增生李斯特菌的毒力[23]。將單核細胞增生李斯特菌懸液通過口服，腹腔、靜脈和皮下注射等方式感染小鼠體，通過計算死亡率來測定毒性，可以得到藥物半數(shù)致死量（LD50）。通過比較不同菌株作用下小鼠的LD50值，就可以粗略的判斷毒性強度。也有人通過研究其在感染小鼠臟器如脾臟等的分布和增殖情況來確定細菌毒力[21]。

3.2 體外細胞實驗

體外細胞實驗比動物實驗成本低，包括J774或者人類結(jié)腸癌細胞Caco-2毒性試驗，HT-29、Henle407或L2細胞的空斑形成試驗、雞胚模型毒力試驗和Caco-2細胞侵襲及胞內(nèi)增殖試驗[24-25]。細胞實驗的原理是檢測單核細胞增生李斯特菌對細胞的黏附、侵襲能力以及在細胞中生長和傳播的能力。

3.3 毒力基因的PCR技術(shù)

單核細胞增生李斯特菌基因組中存在許多毒力基因，這些毒力基因存在與否影響著細菌的致病性強弱。聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是早期發(fā)展起來的一種分子生物學檢測技術(shù)，近幾年，PCR技術(shù)因其特異性強、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等優(yōu)點已成為檢測單核細胞增生李斯特菌毒力基因的常規(guī)手段。單核細胞增生李斯特菌毒力基因存在部分特異性片段，PCR方法就通過對該片段設(shè)計并選擇相應(yīng)的特異性引物，從而對單核細胞增生李斯特菌的主要毒力基因進行選擇性擴增，并從瓊脂糖電泳圖上比對擴增片段大小，或進一步對擴增片段進行測序比對[26-27]。為了進行更準確的檢測，多重PCR在毒力檢測中也發(fā)揮著重要作用[28]。同時，隨著近年來測序成本的降低，使用DNA測序來分析單核細胞增生李斯特菌的毒力已經(jīng)成為一種簡單快捷的方法。我們可以通過對不同單核細胞增生李斯特菌株進行DNA測序，通過分析基因組信息，從基因水平的差異來探究不同菌株表型和致病性等方面的相似性和差異性。致病菌株和非致病菌株之間可能會由于基因水平的轉(zhuǎn)移或基因缺失、插入或突變導致表型的變化[29]。DNA測序是一種準確、便捷、穩(wěn)定的測定毒力的方法，可以從基因水平層面揭示觀測到的毒力效果。

3.4 蛋白水平檢測

單核細胞增生李斯特菌分泌的一系列和毒力有關(guān)的蛋白質(zhì)，與其致病性有很大關(guān)聯(lián)。一些基因突變株會產(chǎn)生一些沒有功能的蛋白質(zhì)，或者某些毒力基因沒有表達，未產(chǎn)生毒力蛋白，導致菌株的毒力下降，因而檢測毒素蛋白也是檢測單核細胞增生李斯特菌毒力的一種輔助方法[30-31]。例如蛋白質(zhì)印跡（western印跡法），曾被報道用于檢測毒力大質(zhì)粒編碼的蛋白。這是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢驗樣品中某種蛋白質(zhì)的方法，因其具備高特異性和敏感性的特點，現(xiàn)已經(jīng)成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)[32]。同樣，酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）也被成功地用于多種致病菌的免疫診斷，具有靈敏、特異、簡單、穩(wěn)定以及易操作等特點[31]。但在對單核細胞增生李斯特菌的檢測中，常將ELISA與PCR聯(lián)合起來用于檢測毒力基因，而不是用來檢測毒素蛋白。在PCR-ELISA中PCR擴增時，引物用抗原標記，這樣擴增產(chǎn)物中就會有抗原。擴增產(chǎn)物與微孔上的捕獲探針雜交，捕獲靶序列，再加入酶標記的抗體，使抗體與靶序列上的抗原結(jié)合，然后加入底物顯色，從而可以實現(xiàn)定量檢測[33-34]。

4 結(jié)語

近些年，歐美國家爆發(fā)了多起由單核細胞增生李斯特菌引起的食源性疾病，對食源性單核細胞增生李斯特菌的檢測控制，對其致病機理、毒力因子的深入研究得到了多個國家政府的支持。伴隨著多學科交叉發(fā)展，單核細胞增生李斯特菌毒力的檢測正向綜合方向發(fā)展，即層次水平的檢測，包括基因水平、基因表達水平、蛋白水平以及這些水平的聯(lián)合檢測，未來的發(fā)展方向?qū)⒏_、更快捷、更靈敏。

現(xiàn)有的研究已經(jīng)對單核細胞增生李斯特菌的十幾種主要毒力因子的結(jié)構(gòu)、功能、侵襲性、致病性等作出了比較全面的詮釋。隨著對單核細胞增生李斯特菌的深入研究，單核細胞增生李斯特菌耐酸、耐高鹽、耐低溫有關(guān)的毒力因子也不斷被研究人員發(fā)現(xiàn)。研究其對極端條件的抗性機理，對于開發(fā)出破壞單核細胞增生李斯特菌抗性的方法有指導意義；對其他與單核細胞增生李斯特菌致病機理密切相關(guān)的毒力因子，特別是毒力調(diào)控因子的研究，更能為預(yù)防單核細胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的檢測和控制提供理論依據(jù)。因此，單核細胞增生李斯特菌的相關(guān)研究有待進一步的開展。