豬精液常溫保存研究進展

白緒祥，韓帥琪，胡建宏

(1.陜西省林業(yè)科學(xué)院珍稀野生動物救護基地，陜西 周至 710402；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院)

如今，人們對于優(yōu)質(zhì)肉奶蛋等畜產(chǎn)品的需求隨著我國居民生活質(zhì)量的不斷提高在持續(xù)地增加，這一變化也推動了我國畜牧業(yè)的不斷發(fā)展。在現(xiàn)代家畜的繁育過程中，我國養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展離不開強大的技術(shù)手段的支持，而人工授精技術(shù)就是其中重要的一環(huán)。人工授精技術(shù)不但可以使優(yōu)良基因得以迅速擴散，而且還可以減少相關(guān)畜禽類疾病的傳播。在這一過程中，由于公豬的精液品質(zhì)直接決定著母豬的受胎率，因此生產(chǎn)實踐對種公豬精液提出了更高的要求。精液的保存也就成為了進行生豬人工授精時的關(guān)鍵性問題。

目前而言，精液保存分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存三種方式，但是經(jīng)過低溫保存和冷凍保存的精子往往活力較低，容易使母豬繁殖成績無法達到期望目標(biāo)，從而影響到養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。所以我國大多數(shù)生豬養(yǎng)殖場在進行人工授精時會選擇以液態(tài)常溫保存為主的精液，同時由于體外保存的精液質(zhì)量會受到各種因素的影響，因此進行常溫保存時稀釋液的配方也成為關(guān)注的焦點。

1 豬人工授精技術(shù)的研究概況

在家畜繁衍的過程進程中，人類總是在嘗試各種手段以期對其繁殖活動進行掌控，從而提高家畜的繁殖性能，滿足人類需求。而人工授精技術(shù)便是其中使用最為普遍的手段。18世紀(jì)80年代，世界上首次人工授精試驗完成，1932 年利用豬鮮精精液進行人工輸精在實驗室第一次取得了成功，直到上個世紀(jì)80年代，人工輸精這項技術(shù)才真正的開始在生豬養(yǎng)殖業(yè)中進行發(fā)展和商業(yè)化應(yīng)用。我國豬的人工授精業(yè)于上個世紀(jì)50年代起便開始在廣西、江蘇等地興起。隨著規(guī)?；s化飼養(yǎng)方式的逐漸興起，人工授精技術(shù)也開始在我國普及開來，在過去10年里，公豬自動化采精系統(tǒng)、母豬深部輸精和精液保存等系列技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用使得豬繁殖技術(shù)和生物安全性得到了極大的提生。而子宮頸后輸精、子宮深部輸精和腹腔鏡輸精技術(shù)等多種輸精方式的出現(xiàn)及應(yīng)用，也使豬人工授精的效率在一定程度上得到了提高。

人工授精技術(shù)是規(guī)模化豬場母豬繁殖的主要形式。就以往的方式而已，一頭公豬每次交配僅僅只能使一頭母豬懷孕，使優(yōu)良種公豬資源得到了極大浪費。依靠人工檢測發(fā)情，母豬能夠每天在站立發(fā)情的狀態(tài)下接受兩次傳統(tǒng)或低精子劑量的子宮頸或兩次子宮內(nèi)受精。每次輸精使用的精液均為經(jīng)過檢驗的優(yōu)質(zhì)精液。加之合適的輸精時間，母豬受胎率得到了極大的提高。同時也使種公豬的配種效率和種用性能得到了充分的利用。

人工授精還能夠克服雜交配種困難以及時間和地域的限制，使繁殖和育種工作不受時間以及空間的限制，使得優(yōu)良遺傳資源得到了充分的利用和廣泛的傳播。而精液的保存技術(shù)可以使精液長期保存下來，使得技術(shù)人員能夠選擇在任意時間和地點對家畜進行人工授精操作。冷凍保存的精液更是使精液的跨境以及國際貿(mào)易成為可能，優(yōu)秀的遺傳資源在這一過程中被傳播開來。

2 豬精液常溫保存技術(shù)研究進展

在生豬人工授精技術(shù)中的豬精液的保存是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。按照精液存儲時溫度的差異可將其分為三種方法：一是常溫保存通常在15～25 ℃下進行，二是在0～4 ℃進行的低溫保存，三是將精液保存于-79 ℃(干冰)或-196 ℃(液態(tài)氮)的環(huán)境下稱為超低溫保存(冷凍保存)。在實際生產(chǎn)中，由于冷凍精液所需要的生產(chǎn)成本更高，并且精子活率遠不如常溫保存，容易降低母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，所以對于我國規(guī)?；i場而言絕大多數(shù)都選擇使用液態(tài)常溫下保存的精液進行人工授精，僅有少部分會使用冷凍精液。盡管精液常溫保存存在著時間相對較短的問題，但具有精子活力高、精子受到損傷小、母畜受孕率高、設(shè)備要求低、人員操作簡單等優(yōu)點。

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 23238-2009)中關(guān)于豬精液常溫保存的要求，精液在稀釋保存3d后的精子活力不得低于60%，而精子畸形率更是不得高于10%。因此在種公豬精液常溫保存過程中，常通過向稀釋液中加入緩沖物質(zhì)來為精子創(chuàng)造生存所需要的最適pH環(huán)境，添加一定的抗菌物質(zhì)來延緩精液中微生物生長速度，以降低微生物的危害。同時加入適當(dāng)?shù)墓?，葡萄糖等糖類物質(zhì)為精子提供營養(yǎng)物質(zhì)，以期精液保存達到一個優(yōu)秀的效果。劉琦等發(fā)現(xiàn)，氨基酸類保護劑(?；撬帷-谷氨酰胺)和中藥活性成分(五味子乙素、三七皂苷R1)可以作為一種質(zhì)膜保護劑，在精液常溫保存的過程中具有保護精子質(zhì)膜不受損害，增強精子的抗氧化能力，維持精子活率的作用。整體來說，精液的常溫和低溫保存技術(shù)已達到相對成熟的水平，但仍存在著精子的質(zhì)膜完整率和頂體完整率難以保證，精子結(jié)構(gòu)和功能不穩(wěn)定等問題，這些問題的解決需要人們?nèi)ミM行更加深入的研究探討。

3 豬精液常溫保存稀釋液成分

在生產(chǎn)實踐中，優(yōu)良的豬精液保存稀釋液能夠有效地提高母豬的受胎率與產(chǎn)仔率，使生豬養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益得到極大提升。以目前市場上存在的豬精液常溫保存稀釋液為準(zhǔn)，其成分主要有單糖、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)、用以保持稀釋液pH和滲透壓穩(wěn)定的無機鹽和有機酸，降低微生物代謝與繁殖水平的抗菌物質(zhì)以及抗氧化物質(zhì)等。

3.1 稀釋劑和營養(yǎng)劑

進行精液保存時稀釋液的滲透壓應(yīng)與精液滲透壓保持在同一水平，生產(chǎn)中常使用蔗糖、葡萄糖、氯化鈉溶液等作為稀釋液等滲物質(zhì)。洪潔赟等研究發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水相比，含有葡萄糖的精液稀釋液中的精子活率顯著更高，這表明葡萄糖能夠為精子提供維持精子正常代謝的能量。如果稀釋液中缺乏葡萄糖則會使精子所需的能量無法滿足，使精子的活率降低。在精子代謝過程中除了通過糖酵解產(chǎn)生的葡萄糖提供能量外，還存在著磷酸戊糖途徑(PPP)和三羧酸循環(huán)。Qiu等的研究表明，公豬精子在17 ℃環(huán)境下儲存時的代謝所需的能量可以由精液稀釋液中提供葡萄糖和果糖的前體物質(zhì)所滿足。Bresciani等則通過對山羊精液儲存過程中精子代謝時葡萄糖的代謝途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)相對于乳酸而言，葡萄糖和丙酮酸在保持山羊精子活力方面有著更好的效果。雖然糖酵解和PPP二者都不可或缺，但PPP比糖酵解對維持精子活力更為重要。PPP可以有效的減少氧化應(yīng)激，并且能夠為糖酵解反應(yīng)提供更多的中間產(chǎn)物。在單羧酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的作用下，丙酮酸進入山羊精子，參與三羧酸循環(huán)和電子轉(zhuǎn)移氧化，以維持精子的活力。

3.2 保護劑成分

3.2.1 緩沖物質(zhì) 精液的pH環(huán)境可以影響精子的運動能力與代謝水平，在弱酸性環(huán)境中，精子的代謝和運動能力受阻，存活時間得以延長。然而在精液保存時，由于精子會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH過低，影響精子活率。因此，在進行精液常溫保存時，通常會選擇向稀釋液中添加一定量的像弱堿性物質(zhì)一類的緩沖物質(zhì)來中和精子產(chǎn)生中的酸性代謝產(chǎn)物，避免因pH過低而使豬精液保存時間和保存效果降低。目前，市場上常被用來作緩沖劑的物質(zhì)主要有磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉等，這類緩沖液可以有效地維持精液pH的穩(wěn)定性。洪潔赟等研究報道，在稀釋液中添加檸檬酸導(dǎo)致稀釋液的pH相對較低，影響細胞膜滲透壓，且添加碳酸氫鈉能夠起到緩沖作用。近些年來，實際生產(chǎn)過程中通常還會選擇像三羥基甲級甲烷(Tris)及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)這類的有機緩沖物質(zhì)作為稀釋劑中的緩沖物質(zhì)。

3.2.2 抗菌物質(zhì) 在精液在采集和保存的過程中，微生物的大量繁殖往往會降低精液品質(zhì)，極大的縮短了精液保存時間。添加抗生素則可以讓細菌污染得到有效的控制。在精液保存過程中，添加鏈霉素或青霉素可極大的延緩微生物的生長速度，從而達到提高精子的保存時間及精子活性的目的。張金龍等通過對比多種不同抗生素對豬精液稀釋液的效果，發(fā)現(xiàn)對精液保存的效果最好的是磺胺類抗生素，在18 ℃的環(huán)境條件下精子的有效保存時間可達4.38 d，精子的存活指數(shù)為3.14。然而抗生素的過多使用也導(dǎo)致了細菌對過去常用的抗菌劑諸如青霉素、鏈霉素等已經(jīng)產(chǎn)生了很強的耐藥性，所以很多科學(xué)家積極致力于開發(fā)抗生素的替代物。為了保護公豬精液，越來越多的研究人員將目光聚焦于基于抗菌肽(AMP)的常規(guī)抗生素替代品。Schulze等研究表明，陽離子抗菌肽能夠作為一種新型的抗菌添加劑用于豬精液稀釋液中，添加后可以對公豬精液保存產(chǎn)生一個良好的效果。在16 ℃的環(huán)境溫度下，合成的環(huán)六肽(c-WFW)和合成的螺旋藻皂苷II酰胺衍生物可以使公豬精子保存4天。

3.2.3 抗氧化物質(zhì) 精子在進行呼吸代謝時會產(chǎn)生ROS。處于低濃度的ROS環(huán)境下精子的活力和受精能力均會得到增強；然而當(dāng)濃度超過一定范圍時，ROS會作用于精子質(zhì)膜，使精子質(zhì)膜上磷脂產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，從而破壞精子的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，使精子的功能無法發(fā)揮；ROS 還可以通過破壞精子細胞核中的DNA 結(jié)構(gòu)的方式引起精子凋亡；此外，ROS 可降低精子質(zhì)膜和胞內(nèi)酶的活性或者造成酶失活，使ROS 大量聚集在精子細胞內(nèi)導(dǎo)致一種惡性循環(huán)，使精子氧化損傷加深而死亡。

研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽及其還原性前體可以有效地緩解蛋白質(zhì)分子和酶分子的氧化壓力以及抵抗細胞凋亡，使精子的活力和受精能力得到有效的提升。褪黑激素則具有較強的抗氧化作用，并且能使谷胱甘肽氧化酶的活性得到極大的增強，從而實現(xiàn)延緩精子衰老的目標(biāo)。另外VE也可以通過抑制自由基的形成，防止精子質(zhì)膜上發(fā)生氧化反應(yīng)以及破壞活性氧在脂肪酸側(cè)鏈和質(zhì)膜中形成的共價鍵來起到抵抗活性氧的作用。

3.2.4 其他添加劑 在精液常溫保存稀釋液中也可以添加一些酶類、維生素或激素類物質(zhì)等。例如可以通過添加過氧化氫酶來分解精子代謝過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，在一定程度上達到延長精子存活時間的目的。像二氧化碳、乙酸等其他添加劑成分則可以降低精液的pH，抑制精子的運動能力，減少精子本身的能量消耗。而還有一些物質(zhì)作為添加劑可以對母畜造成一定影響，例如催產(chǎn)素、前列腺素等激素類物質(zhì)可以通過促進母畜生殖道的蠕動，來提高母畜受胎率，以此提高經(jīng)濟效益。