三氧化二砷聚乳酸納米粒的制備及在大鼠體內(nèi)藥動學

王琪，耿雪，徐世一，蘇慧，李雪瑩，郝若祎，霍元子,閻雪瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

三氧化二砷(As2O3，ATO)為白色霜狀粉末，故稱“砒霜”，是中藥砷的有效成分，自2000年ATO被批準作為治療急性早幼粒細胞白血病的一線藥物以來，其對各種惡性腫瘤的抗癌作用一直是人們研究的熱點[1-3]。然而，由于其藥代動力學差，半衰期短，給藥后消除迅速[4]，還有劑量限制不良反應，使它在體內(nèi)對實體瘤的作用受到限制[5]。為了改善三氧化二砷的藥代動力學，避免ATO的毒性和副作用，增強其抗腫瘤作用，許多新型的As2O3藥物制劑也受到了廣泛的關注[6]。

近年來，納米技術于藥物載體的應用，大大提高了難溶藥物的溶解度；對載體材料表面功能化，使這類載體制備的制劑具有高效低毒的優(yōu)點[7]。目前，許多納米粒子(NPs)正在進行藥物釋放研究，包括用于癌癥治療的藥物釋放研究[8]。聚乳酸(PLA)是多個乳酸分子之間的羥基和羧基脫水聚合形成的高分子聚合物，可生物降解，其降解反應容易發(fā)生，最終降解產(chǎn)物為H2O和CO2，隨代謝排出體外，不會對機體產(chǎn)生任何傷害。且作為藥物載體材料，聚乳酸可提高藥物的溶解度和生物利用度，還具有靶向作用[9]。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)由于分子中含有大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，因而具有良好的親水性，經(jīng)聚乙二醇修飾的藥物分子可明顯增加水溶性。聚乳酸經(jīng)聚乙二醇修進入人體后，毒副反應更小、且能有效逃避免疫防御系統(tǒng)的吞嚼作用，使聚乳酸成為優(yōu)良的藥物載體材料[10]。

本研究以As2O3為模型藥物，以聚乳酸、聚乙二醇修飾的聚乳酸為載體材料制成納米粒，對粒徑分布、Zeta 電位、體外釋藥等進行研究。比較游離狀態(tài)和不同載體狀態(tài)下的As2O3體內(nèi)藥動過程。為As2O3新型遞藥系統(tǒng)的構建及其在腫瘤治療中的應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

原子吸收光譜儀(德國耶拿分析儀器股份公司，novAA400p)；氬氣鋼瓶；超聲波細胞破碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司，Scientz-IID)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術有限公司，R-205B)；數(shù)控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術有限公司，W202B)；pH計(DELTA320，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano-ZS90，馬爾文儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(HJ-6A，金壇市榮華儀器制造有限公司)；恒溫水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司，HZS-HA型)；分析天平(Sartorius BT25S，德國Sartorius公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；2K系列實驗室冷凍干燥機(美國Virtis公司)；智能型獨立通氣大鼠IVC 實驗動物凈化籠具(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)；Allegra 64R型高速冷凍離心機(美國Beckman 公司)；EHD型智能電熱消解儀(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

砷單元素標準溶液(樣品編號：12071，中國計量科學研究院)；三氧化二砷(批號：548CC888720，Merck Parmstadt)；Poloxamer 188 (上海協(xié)泰化工有限公司)；聚乳酸(PLA，M=15000，15011603，濟南岱罡生物工程有限公司)；mPEG-聚乳酸(mPEG-PLA，MPEG=3500，15062303，濟南岱罡生物工程有限公司)；透析袋(MW：8000-14400，美國Sigma公司)；實驗用水為去離子水；鹽酸、抗壞血酸、硫脲為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SD大鼠56只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 三氧化二砷聚乳酸納米粒包封率的測定方法

2.1.1 儀器工作條件的選擇

參考文獻[11]確定。電燈流：10.0 mA;光譜通帶：0.5 nm;波長：193.7 nm;空氣流量：13.50 L/min;乙炔流量：2.00 L/min;還原劑：1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液(臨用現(xiàn)配);載液：鹽酸(5→100)溶液;載氣：氬氣(分壓為0.3 MPa);背景校正：氚氣。

2.1.2 標準曲線的繪制

砷標準儲備液濃度為1 000 μg/mL，將其以5% HCl逐級稀釋成濃度為0.10 μg/mL的砷標準工作液，精密吸取0.10、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加入5 %硫脲-抗壞血酸溶液1.0 mL，以5%鹽酸定容至刻度線，混勻，使砷濃度為1.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/L，測定其吸光值，結果扣除空白溶液的吸光值。以砷濃度C (μg/L)為橫坐標，扣除空白吸光值后不同濃度砷的吸光值A為縱坐標進行線性回歸，得到砷的線性回歸方程為：Y=0.085 6X+0.630 7，相關系數(shù)為R2=0.999 7。結果表明：砷對照品濃度在1.0～50.00 μg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3 包封率和載藥量

分別精密吸取As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs分散液1.00 mL，裝入處理后的透析袋中，扎緊袋口，置于透析外液為200.0 mL雙蒸水的燒杯中。將燒杯放入水浴振蕩器中，室溫、恒速(100 rmp)動態(tài)透析，在420 min時，精密吸取透析外液2.0 mL進行測定分析，測定計算納米粒溶液中游離的As2O3量為W游，投入的As2O3為W總，同法重復3次。包封率、載藥量計算公式如下：

ER (%) = (W總-W游) / W總×100 %

DL (%)= (W總-W游) / WP×100 %

公式中，ER:包封率；DL:載藥量；W總:總藥量；W游:游離藥量；Wp:載體重量。

2.2 納米粒制備工藝優(yōu)化

2.2.1 納米粒的制備工藝

2.2.1.1 As2O3-PLA-NPs的制備工藝

采用復乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒，精密稱量PLA 40.00 mg，加入1.50 mL乙酸乙酯(與水相比例為1∶4)，超聲至完全溶解。精密吸取濃度為10.00 mg/mL的As2O3溶液100.00 μL，100 W超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)，將初乳加入到6.00 mL含6%吐溫20的外水相中，80 W冰浴超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)形成復乳，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去有機溶劑，以去離子水轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度線，即為最終樣品。

2.2.1.2 As2O3-mPEG-PLA-NPs的制備工藝

采用“2.2.1.1”上述制備方法，精密稱量mPEG-PLA 40.00 mg，加入2.50 mL乙酸乙酯(與水相比例為1∶3)，超聲至完全溶解。精密吸取濃度為10.00 mg/mL的As2O3溶液100.0 μL，100 W超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)，將初乳加入到6.00 mL含3 %吐溫20的外水相中，80 W冰浴超聲60 s(超聲2 s，間歇2 s)形成復乳，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去有機溶劑，以去離子水轉(zhuǎn)移至25.00 mL容量瓶中，定容至刻度線，即為最終樣品。

2.2.2 正交實驗優(yōu)化制備工藝

2.2.2.1 As2O3-PLA-NPs正交實驗優(yōu)化制備工藝

結合前期As2O3-PLA-NPs單因素考察的結果綜合來看，PLA的量( A )、As2O3的量(B)、Tween20的濃度(C)和有機相與水相的比例(D)為主要影響因素。各因素設計3個不同水平，以包封率為主要評價指標,按L9(34)正交試驗設計表安排實驗，篩選最優(yōu)處方和制備工藝。因素水平和實驗設計見表1。

表1 As2O3-PLA-NPs正交設計結果(n=3)

根據(jù)表1中極差值Rj和方差分析(表2)可知，各因素影響的主次順序是B>C>A>D可以得出最優(yōu)處方組合為：A3B3C3D2。即PLA為40.00 mg， As2O3為3.00 mg，吐溫20濃度為6 %，有機相為1.50 mL，且與水相比例為1:4。按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批As2O3-PLA-NPs，結果顯示，平均包封率為91.75%，RSD=0.38%，重現(xiàn)性良好。

表2 As2O3-PLA-NPs方差分析結果

2.2.2.2 As2O3-mPEG-PLA-NPs正交實驗優(yōu)化制備工藝

結合前期As2O3-mPEG-PLA-NPs單因素考察的結果綜合來看，mPEG-PLA的量(A)、As2O3的量(B)、Tween20的濃度(C)和有機相與水相的比例(D)為主要影響因素。各因素設計3個不同水平，以包封率為主要評價指標按L9(34)正交試驗設計表安排實驗，篩選最優(yōu)處方和制備工藝。因素水平和實驗設計見表3。

表3 As2O3-mPEG-PLA-NPs正交設計結果(n=3)

根據(jù)表3中極差值Rj和方差分析(表4)可知，各因素影響的主次順序是A>D>B>C可以得出最優(yōu)處方組合為：A3B3C2D1。即mPEG-PLA:40.00 mg；As2O3：3.00 mg；吐溫20濃度為3%；有機相為2.50 mL，且與水相比例為1:3。按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批As2O3-PLA-NPs，結果顯示，平均包封率為86.32%，RSD=0.54%，重現(xiàn)性良好。

表4 As2O3-mPEG-PLA-NPs方差分析結果

2.3 三氧化二砷納米粒凍干工藝研究

制得的納米粒子溶液采用4 ℃的低溫離心(1 000 rpm)5 min，沉淀用去離子水反復洗滌，除去游離藥物，所得納米粒沉淀用2 mL去離子水再分散。分別考察以5%乳糖、海藻糖、甘露糖、蔗糖為凍干保護劑及不加凍干保護劑的凍干樣品的質(zhì)量。其中納米粒子分散液按體積比1:1加入凍干保護劑溶液。結果顯示，As2O3-PLA-NPs和As2O3- mPEG-PLA-NPs均以5%甘露醇(w/v)凍干后的質(zhì)量最理想，肉眼觀察均為白色、疏松的固體，表面光潔細膩，振搖后能整塊脫落。

2.4 三氧化二砷納米?；拘再|(zhì)

2.4.1 載藥量、外觀、粒徑分布及Zeta電位

按照“2.1.3”項下測定方法，測得As2O3-PLA-NPs和As2O3-mPEG-PLA-NPs的平均載藥量為6.88%(RSD=0.36%)和6.47%(RSD=0.62%)。取兩種三氧化二砷納米粒凍干品適量，加水輕微振搖分散，稀釋后滴加在超薄碳膜上，在透射電鏡下觀察粒子形態(tài)并拍攝照片(圖1)。結果表明，納米粒子呈現(xiàn)較均勻圓形，分散性良好。采用粒徑分析儀測定三氧化二砷納米粒粒徑和Zeta電位(圖2)。測定結果顯示，As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs平均粒徑為(133.20±5)nm、(123.40±6)nm；Zeta電位為-7.11 mV、-6.7 mV。

2.4.2 三氧化二砷聚乳酸納米粒體外釋藥行為

取適量凍干粉(相當于0.40 mg As2O3)，加2 mL去離子水，轉(zhuǎn)入已處理后的透析袋中，將袋口扎緊，放入盛有200 mL釋放介質(zhì)的燒杯中，將燒杯放到恒溫水浴振蕩器37 ℃水浴中，恒速(100 rpm )振搖。分別于0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h量取1 mL釋藥介質(zhì)，同時補入等量同溫空白介質(zhì)，測定各時間點的藥物含量，并計算各時間點的累積釋放度，繪制體外溶出曲線見圖3。由結果可知，將三氧化二砷制備成納米粒后，體外釋藥具有明顯的緩釋釋藥特征。

圖2 As2O3-PLA-NPs和As2O3-mPEG-PLA-NPs的粒徑和Zeta電位分布

圖3 As2O3、As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs凍干粉針劑體外釋放曲線(n=3)

2.4.3 釋藥模型擬合

對As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs體外釋藥分別采用零級、一級、Higuchi 及 Weibull 模型進行擬合(表5, 6)，制備的As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs體外釋藥模型符合Weibull 模型。

Ln[ln(100/100-Q)]=0.334ln(t)-1.256 9(R2=0.969)

Ln[ln(100/100-Q)]=0.380 3ln(t)-1.445 8(R2=0.976 8)

表5 As2O3-PLA-NPs釋放模型和相關系數(shù)

表6 As2O3-mPEG-PLA-NPs釋放模型和相關系數(shù)

2.5 藥動學研究

2.5.1 血漿樣品的處理

解凍凍存血樣，渦旋后離心(4 000 rpm,5 min)，精密吸取上清液100 μL置于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸與高氯酸的混酸(硝酸∶高氯酸=4∶1) 1.5 mL，加蓋，室溫下放置過夜，進行預反應，電熱消解儀130 ℃進行加熱消解，至冒濃煙，隨時觀察溶液顏色，待樣品冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至10 mL比色管中，同時加入硫脲-抗壞血酸1.0 mL，以5%鹽酸定容至刻度線，作為樣品溶液。

2.5.2 對照品溶液的配制及標準曲線的繪制

按照“2.1.2”配置砷溶液，精密吸取一系列不同濃度的砷標準溶液各100 μL，置于10 mL EP管中，精確加入100 μL的大鼠空白血漿，渦旋混勻，按照“血液樣品處理”項下操作配制成相當于含砷濃度為1.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/L 的標準含藥血漿，進樣分析，以砷吸光值為縱坐標A，以血漿中砷的藥物濃度作為橫坐標C (μg/L)進行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=0.084 25X+0.307 2，相關系數(shù)r2=0.993。由相關系數(shù)r可知，在1.0～50.00 μg/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關系。

2.5.3 方法學驗證

配制成濃度為2.00、20.00、40.00 μg/L的質(zhì)控樣品來考察日內(nèi)精密度RSD值。結果顯示RSD值分別為7.29%，6.22%和5.37% (n=6)?？疾? d的日間精密度，3種濃度RSD值分別為2.93%，4.14%和8.04%(n=6)。取100 μL大鼠空白血漿樣品，向其中加入濃度為0.20 μg/mL、2.00 μg/mL、4.00 μg/mL的砷標準儲備液，制成質(zhì)控樣品，按照“2.5.1”項下方法處理血漿樣品。另取100 μL大鼠空白血漿樣品，按照“2.5.1”項下方法處理后，再加入低、中、高3個濃度的等量的砷標準溶液，制備成標準對照樣品，相同方法測定，記錄吸光值，將質(zhì)控樣品的吸光值與對照樣品的吸光值比較，計算提取回收率，結果顯示3種濃度的回收率分別為(77.26±5.33)%、(86.74±4.18)%和(80.67±6.24)%(n=3)。其中，3種濃度的 RSD值<7.16%。任取一份血漿樣品，置于-40 ℃冰箱中于24 h內(nèi)反復融凍，高效液相色譜測定血藥濃度變化。結果顯示，冰凍-溶解重復3次砷血漿樣品依然穩(wěn)定，RSD為9.2%，滿足樣品分析測定要求。

2.5.4 給藥方案及樣品采集

將SD大鼠隨機分為7組，每組8只。稱取納米粒凍干粉適量，以生理鹽水為分散介質(zhì)，配制濃度分別為6.33 mg/mL和6.67 mg/mL的As2O3-PLA-NPs，As2O3-mPEG-PLA-NPs分散液。給藥劑量如下：As2O3生理鹽水注射組(2 mg/kg)，As2O3-PLA-NPs高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低(1 mg/kg)劑量組，As2O3-mPEG-PLA-NPs高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低(1 mg/kg)劑量組。

給藥前12 h禁食，不禁水，各組稱重后，按劑量尾靜脈注射方式對大鼠進行給藥。給藥前采集空白血樣。尾靜脈注射給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、24、36 h，大鼠眼眶取血0.5 mL，置于裝有肝素鈉抗凝劑的離心管中，混勻，-80 ℃凍存待測。

2.5.5 房室模型的建立

分別測定As2O3-PLA-NPs高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低(1 mg/kg)劑量組和As2O3-mPEG-PLA-NPs高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低(1 mg/kg)劑量組血漿樣品血藥濃度，繪制藥動學曲線。藥動學曲線結果見圖4及表7。在As2O3同等劑量下，經(jīng)尾靜脈注射，比較As2O3生理鹽水組和As2O3-PLA-NPs組主要藥動學數(shù)據(jù)，As2O3-PLA-NPs組的消除半衰期是生理鹽水組的1.52倍；藥時曲線下面積明顯增大，As2O3-PLA-NPs組AUC是生理鹽水組的1.42倍。As2O3-mPEG-PLA-NPs組的消除半衰期是生理鹽水組的2.53倍；藥時曲線下面積，As2O3-mPEG-PLA-NPs組AUC是生理鹽水組的2.20倍。藥動學特征顯示，在相同劑量下，As2O3制成納米粒后藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間明顯延長，清除率降低，起到一定的緩釋作用。

圖4 PLA組和mPEG-PLA組As2O3血藥濃度-時間曲線

組別MRT 0-∞(h)AUC0-24[mg/(L·h)]AUC 0-∞[mg/(L·h)]t1/2α(h)t1/2β(h)As2O3生理鹽水組13.83±2.3323 207.31±422.8824 510.01±177.421.11±0.283.25±1.09As2O3-PLA-NPs(L)17.73±1.0214 952.72±271.8817 597.82±164.651.84±0.344.86±1.16As2O3-PLA-NPs (M)29.40±2.7132 907.62±329.6147 465.37±483.222.24±0.634.93±2.11As2O3-PLA-NPs (H)21.48±2.5552 212.56±33.6764 973.25±527.742.51±0.644.82±1.04As2O3-mPEG-PLA-NPs (L)13.68±2.2619 270.23±216.54*21 224.51±334.511.47±0.557.89±1.82*As2O3-mPEG-PLA-NPs (M)17.19±4.8546 546.42±513.29#53 986.41±447.620.93±0.248.21±3.21#As2O3-mPEG-PLA-NPs (H)19.00±2.6674 456.47±379.83△89 191.22±577.391.59±0.787.98±1.92△

3 討論

三氧化二砷納米粒系采用復乳溶劑揮發(fā)法進行制備，推測形成納米粒的過程為：將溶有三氧化砷的水相溶劑加入到溶有聚乳酸的有機溶劑中進行第一次初乳化，形成W/O型反膠團，再加入含表面活性劑的外水相中，進行第二次乳化，形成W/O/W型復乳，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到納米粒[11]。在此過程中，乳化充分、超聲時間、超聲功率是形成均一納米粒的關鍵，通過對制備條件的優(yōu)化，最終選用復乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒，得到As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs平均包封率為91.75%、86.32%和平均載藥量為6.88%、6.47%的最佳的納米粒。雖然在mPEG-PLA和PLA中聚乳酸分子量相同，但是由于每批原料差異和工藝技術的原因，不能保證分子量完全相同，而這直接導致相同工藝下，兩組納米粒的粒徑可能相差甚遠，而粒徑的差異，會直接影響納米粒的體內(nèi)外釋放及對腫瘤細胞的作用，故本部分實驗的重點，是通過工藝技術，得到兩組粒徑相近、包封率較好的納米粒。通過比較不同復乳超聲時間、超聲功率以及調(diào)整油相比例發(fā)現(xiàn)，雖然超聲時間和功率能在一定程度上影響粒徑，但對包封率影響較大，而隨有機相比例增加，納米粒粒徑變化顯著。這是因為，當聚合物濃度低時，有機相黏度低，表面張力較小，分散速度比較快，有利于有機相快速擴散和揮發(fā)除去，因此得到的納米粒粒徑變小[12]。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，納米粒溶液在室溫放置長時間，會引起沉降，影響納米粒穩(wěn)定性，故采用凍干法，制備成凍干粉，可提高納米粒穩(wěn)定性。

本實驗制備的三氧化二砷納米粒粒徑分布均勻，體外釋藥模型符合Weibull模型。體內(nèi)藥動學結果顯示，在相同劑量下，As2O3制成納米粒后藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間明顯延長，清除率降低，起到一定的緩釋作用，改善藥物體內(nèi)生物過程[13]。本研究成功制備了形態(tài)均勻、包封率較高、具有良好生物相容性的三氧化二砷納米粒，為三氧化二砷的后續(xù)開發(fā)及研究拓寬了思路并提供了試驗依據(jù)。