豬源乳酸菌分子生物學(xué)鑒定及黏附性特征

王大會(huì)，李克克，常世愷

（1.麗水學(xué)院中國（麗水）兩山學(xué)院，浙江省 麗水市323000；2.河南金百合生物科技股份有限公司河南省飼用微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，河南安陽市455000）

益生菌是當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)，對宿主產(chǎn)生健康益處的活性微生物。大量研究表明，益生菌能夠改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，構(gòu)建有益的腸道微生態(tài)環(huán)境，抑制病原微生物的增植[1]。益生菌黏附和定植于宿主的腸道是發(fā)揮益生功能的前提，也是評價(jià)益生菌功能的重要特性之一，具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。人和動(dòng)物的腸道菌群具有動(dòng)態(tài)變化和種群繁雜的特性，對單個(gè)益生菌菌株的黏附能力評估通常采用體外細(xì)胞模型來開展，目前常見的細(xì)胞株有腸上皮樣細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、各種原代培養(yǎng)的上皮細(xì)胞以及分離純化的黏液為主。本研究采用16SrDNA序列分析法對實(shí)驗(yàn)室分離保存的3株乳酸菌進(jìn)行分類鑒定。以永生化豬小腸上皮細(xì)胞ZYM-SIEC02作為體外模型，通過革蘭氏染色計(jì)數(shù)法分析益生菌在不同生長時(shí)期的黏附指數(shù)。旨在探索宿主同源性乳酸菌的黏附性能，為乳酸菌黏附定植的生物學(xué)作用提供理論基礎(chǔ)，也為微生態(tài)制劑的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞

試驗(yàn)所用乳酸菌均分離于健康仔豬糞便和不同腸段腸黏液，由本實(shí)驗(yàn)室保存，標(biāo)號分別為H菌、031菌和HN菌。豬小腸上皮細(xì)胞系（ZYM-SIEC02，保藏號：CCTCC-C201001，專利申請?zhí)枺?01010228957.3），由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張彥明教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)液，胎牛血清，美國Gibco公司；溶菌酶，Sigma公司；異丙醇，甲醇，寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖DNA回收試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；DNA Marker DL2000，廣州東盛生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 主要儀器

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；分析天平，上海精科天平公司；-20℃低溫冰箱，日本三洋公司；超凈工作臺，Mettle:AE-00。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的鑒定

（1）菌株的培養(yǎng)擴(kuò)增及革蘭氏染色鏡檢：采用MRS液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h。并對該3株菌進(jìn)行革蘭氏染色，100倍油鏡下觀察。

（2）細(xì)菌基因組DNA提?。簠⒄占?xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)試劑盒說明書。

（3）菌株的16SrDNA基因片段的PCR擴(kuò)增及檢測回收：采用細(xì)菌通用引物[2]，正向引物為5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；反向引物為5′-CTA CGGCTA CCTTGTTACGA-3′。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。

將上述1.2.1.2制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，采用50μL反應(yīng)體系(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 PCR擴(kuò)增體系

循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入以下30個(gè)循環(huán)，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，最后72℃末端延伸10 min。

PCR產(chǎn)物檢測：擴(kuò)增后取9μL的PCR產(chǎn)物與1μL緩沖液混合，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，進(jìn)行電泳，電壓5 V/cm，電泳液為1×TAE。參考DNA回收試劑盒說明將目的條帶切膠回收。

（4）細(xì)菌16SrDNA序列測定：由北京六合華大基因科技股份有限責(zé)任公司完成。

（5）細(xì)菌16SrDNA序列比對分析：登錄NCBI網(wǎng)站，將所得測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。

1.2.2 菌株體外黏附試驗(yàn)

（1）菌懸液的制備：使用MRS液體培養(yǎng)基將菌株活化，37℃搖床孵育，分別于4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h取出。6000 r/min15 min離心后留菌體沉淀，用滅菌PBS調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL備用。

（2）細(xì)胞的培養(yǎng)：使用5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基復(fù)蘇豬小腸上皮細(xì)胞，37℃，5%CO2，每天換液一次，每2 d傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105CFU/mL，接入預(yù)先置入細(xì)胞爬片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，二氧化碳培養(yǎng)箱約28 h后，觀察細(xì)胞至單層或80%左右進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

（3）細(xì)菌的黏附試驗(yàn)[3]：將單層細(xì)胞用滅菌的PBS（pH7.4）漂洗2～3次，每孔加l mLDMEM/F12培養(yǎng)液和l mL菌懸液，順時(shí)針搖勻后繼續(xù)孵育，以空白PBS為對照，不同時(shí)期菌懸液樣品3孔平行，然后繼續(xù)孵育120 min后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3～5次，棄除未黏附的細(xì)菌。取出細(xì)胞爬片，晾干后用甲醇固定20 min，最后進(jìn)行革蘭氏染色。將染色后的玻片置于100倍油鏡下隨機(jī)挑選25個(gè)視野，計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞上黏附的細(xì)菌數(shù)，比較細(xì)菌各生長時(shí)期黏附性強(qiáng)弱。

（4）細(xì)菌生長曲線的測定：MRS液體培養(yǎng)基中接種目標(biāo)益生菌37℃搖床孵育，每兩小時(shí)取樣，450 nm檢測不同時(shí)間的OD值，做出該菌的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的菌落形態(tài)及染色特性

如圖1所示，對該3株益生菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，100倍油鏡觀察均為革蘭氏陽性。

圖1 HN菌（a）、031菌（b）、H菌（c）革蘭氏染色鏡檢(×1000)

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 菌株16SrDNA基因片段的PCR擴(kuò)增

由圖2可知，3株菌株的16SrDNA基因序列長度均在約1500 bp左右，

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2.2 細(xì)菌16SrDNA序列比對

登陸NCBI網(wǎng)站，經(jīng)核酸比對，菌株H，031和HN分別與唾液乳桿菌，糞腸球菌和約氏乳桿菌在核苷酸水平相似性為99%。

2.3 不同生長時(shí)期H菌對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附性能

H菌在4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h不同生長時(shí)期對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附見圖3，均為革蘭氏染色，×1000。不同生長時(shí)期H菌對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附性能不同，其中以培育16 h和20 h的H菌黏附的個(gè)數(shù)最多（圖3）。

圖3 孵育4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h的H菌對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附

以50個(gè)細(xì)胞上的細(xì)菌黏附數(shù)的平均數(shù)加減其方差表示（X±S），不同時(shí)期H菌黏附數(shù)變化規(guī)律如圖4所示。

圖4 不同生長時(shí)期H菌對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附數(shù)

2.4 H菌生長曲線的測定

從圖5可以看出，H菌在前8 h處于緩慢生長期，8～12 h處于對數(shù)生長期，12～28 h處于穩(wěn)定期，28 h后處于衰老期。

圖5 H菌的生長曲線

3 討論

3.1 乳酸菌的鑒定

經(jīng)基于16SrDNA序列分析法初步確定了室驗(yàn)室分離保存的3株益生菌的種屬。在種這個(gè)分類等級上，如果兩個(gè)分類單位間的16SrRNA基因的同源性大于97.5%，則認(rèn)為它們屬于同一個(gè)種[4]。本研究中3株菌均具有對應(yīng)16SrDNA序列相似性為99%的菌株，由此可認(rèn)為，H菌為唾液乳桿菌，031菌為糞腸球菌，HN菌為約氏乳桿菌。

3.2 乳酸菌不同生長時(shí)期對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附性

乳酸菌是應(yīng)用最為廣泛的益生菌種類之一，是機(jī)體腸道內(nèi)的重要原生菌群，乳酸菌可以黏附定植于腸道黏膜和上皮細(xì)胞，從而形成穩(wěn)定的菌群，對維持腸道微生態(tài)平衡和功能起有益作用[5，6]。乳酸菌要發(fā)揮益生作用，對腸道上皮細(xì)胞的黏附是定植及增殖的前提，因此，評估益生菌的黏附性能，是評價(jià)益生菌功能的重要指標(biāo)[7、8]。試驗(yàn)菌株在不同生長時(shí)期黏附性差異顯著（P＜0.05)，37℃孵育16～20 h時(shí)黏附性能最佳，通過對實(shí)驗(yàn)菌株生長曲線的測定我們可以得出，乳酸菌穩(wěn)定期的黏附指數(shù)最高。不同生長時(shí)期菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面成分和代謝產(chǎn)物等均有差異，這可能是造成黏附指數(shù)差異的原因[9、10]。