段為旦,冷偉芳,劉謝緣,冷桂華,習小文,廖金賢
(1.宜春學院化學與生物工程學院,江西宜春 336000;2.上海海洋大學食品學院,上海201306;3.撫州市農(nóng)業(yè)技術推廣中心,撫州344000;4.集美大學海洋食品與生物工程學院,福建廈門361021)
大豆是一年生草本植物,世界上許多國家的比較重要的豆類,根據(jù)大豆的種子和種皮可以分為飼料豆、青大豆、黃大豆、黑大豆和其他大豆[1]。大豆中富含許多優(yōu)質蛋白,含有豐富的人體必需氨基酸[2],同樣也是許多動物飼料中的植物蛋白原料。但大豆蛋白的分子量相當大,分子結構復雜,所以在動物胃腸道里面經(jīng)過消化酶作用后,主要以肽的形式被吸收。大豆蛋白不但為生物體提供生長、發(fā)育所需的營養(yǎng),還能提高其身體免疫力,促進其新陳代謝[3]。豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)物,豆粕是制作動物飼料的主要原料,還可以用來制作糕點食品、以及化妝品和抗菌素原料。以豆粕為原料,經(jīng)過微生物發(fā)酵分解生成許多小分子物質如多肽類等。
大豆肽是生物活性肽,在代謝調控方面具有非常重要的作用,其中一些多肽的理化性質比大豆蛋白好,溶解性比較好,吸水性比較穩(wěn)定,基本不受PH影響,具有較好的低黏性和較高的流動性,此外,降解豆粕小分子物質的相對分子量較?。?000KD),容易消化吸收,其致敏性也比較低,適合食品、動物飼料、魚粉等的生產(chǎn)加工。降解豆粕在工業(yè)生產(chǎn)中主要以酶水解法和微生物發(fā)酵法為主[4][5],微生物水解法又包括固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法,酶水解法制備的產(chǎn)品會產(chǎn)生不利于產(chǎn)品的味道,使產(chǎn)品口感差[6]。所以本試驗采用微生物發(fā)酵法中的固態(tài)發(fā)酵法,改善降解豆粕產(chǎn)生的大豆肽的品質,提高大豆肽的產(chǎn)量,消除抗營養(yǎng)因子[7],對發(fā)酵條件進行優(yōu)化,完善好豆粕發(fā)酵的工藝,來提高降解豆粕的效率,為大豆肽以及動物飼料的后續(xù)研究試驗及工業(yè)化生產(chǎn)與應用提供基礎。
枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌、根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉為實驗室提供菌種。
大豆粕(粉碎過篩)、麩皮(均為市場購買);牛血清蛋白(標準品);葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、硝酸銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、福林酚試劑、甲醛等
分析天平、紫外可見分光分光光度計、離心機、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、酸度計、磁力攪拌器、全自動高溫殺菌鍋、烘箱
保存菌種→菌種活化→菌種擴增→接種→發(fā)酵轉化→滅活→粉碎→浸提→離心→取上清液→測可溶性蛋白含量、多肽含量、氨基酸含量
2.2.1 菌種活化2.2.1.1根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐菌種培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)
20%馬鈴薯、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.05%氯化鎂、0.03%磷酸二氫鉀、0.03%磷酸氫二鉀,自然PH,配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中,將保藏在甘油管的根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中,在28℃、120r/min條件下恒溫搖床中活化培養(yǎng)7d左右。
2.2.1 .2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基
1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%氯化鈉,自然PH,配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中,將保藏在甘油管的枯草芽孢桿菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中,在37℃、120r/min條件下恒溫搖床中活化培養(yǎng)2d左右。
2.2.1 .3 酵母菌培養(yǎng)基
1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖,自然PH,配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中,將保藏在甘油管的酵母菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中,在37℃、120r/min條件下恒溫搖床中活化培養(yǎng)2 d左右。
2.2.1 .4 乳桿菌培養(yǎng)基
乳桿菌培養(yǎng)基:5%牛肉膏、0.5%蛋白胨、0.5%酵母浸,PH調至6.8,配制成50mL培養(yǎng)基。將保藏在甘油管的酵母菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中,在37℃、120r/min條件下恒溫搖床中活化培養(yǎng)2d左右。
活化結束后,枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母桿菌等菌菌液出現(xiàn)明顯渾濁,而根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉等菌液中菌體成可見團狀,菌液表面覆蓋一層白色菌膜,若菌體保存時間過久,初始活力不足,可適當延長活化時間。
2.2.2 種子液擴增培養(yǎng)
活化和擴增的培養(yǎng)基成分一致,將裝有的種子液擴增培養(yǎng)基的錐形瓶包扎好放入高壓滅菌鍋,在121℃,0.12MPa的條件下殺菌30min。待殺菌完成后,將錐形瓶放入超凈工作臺上冷卻。溫度合適時,取適量的活化后的菌液,注入的含相適應培養(yǎng)基的錐形瓶中,接種時注意防止染上雜菌,接種后用紗布或者牛皮紙封口,輕輕搖勻混合,放入37℃、轉速為180r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24h(根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉培養(yǎng)72h)。將擴增后的菌液作為種子液備用。
2.2.2 發(fā)酵轉化
將活化擴增好的種子液在無菌環(huán)境下接種到固體培養(yǎng)基中,置于恒溫生化培養(yǎng)箱中,在不同的發(fā)酵條件下,復合微生物利用自身產(chǎn)生的酶將豆粕進行降解,分解轉化成許多小分子物質。
2.2.3 發(fā)酵液的提取
豆粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后,將發(fā)酵后的豆粕及其菌種放入100℃的烘箱進行30min加熱滅活。滅活后的豆粕用研缽進行研磨粉碎處理,處理好的樣品稱取0.5g,加入8mL蒸餾水并放入超聲器里超聲、水浴加熱65℃30min進行浸提,用振蕩機振蕩5min,倒出上層液體于離心管中,以10000r/min轉速離心10min。離心后倒出上清液,取到所需的發(fā)酵液。
2.3.1 水溶性蛋白、多肽的測定
2.3.1 .1 蛋白質標準曲線繪制[8]
精確稱量0.0025g的牛血清蛋白,于10mL容量瓶中配制成250μg/mL的標準蛋白液,取七只試管編號,分別取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入七只試管中,再加蒸餾水至1mL,然后依次加入堿性銅溶液5mL,搖勻混合,靜置10min后,加入試劑乙(福林酚試劑)0.5mL,立即混勻,于避光靜置30min,以1號管為空白,在680nm波長處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標,標準蛋白濃度為橫坐標繪制標準曲線,標準蛋白溶液濃度于吸光度的關系見圖1,圖1中吸光度值為3次測試結果的平均值,其回歸方程為y=0.002x+0.0037,相關系數(shù)R2=0.9989。
2.3.1 .2 水溶性蛋白的測定[8]
將浸提好的發(fā)酵液放入離心管中于轉速10000r/min的離心機中離心10min,上清液倒出備用,準確吸取1.0mL的上清液,稀釋至適合的濃度(測定吸光度值在0.2~0.8之間),在稀釋至一定濃度的試管中分別加入堿性銅溶液5mL,搖勻,靜置10min后,加入福林-酚試劑0.5mL,立即混勻,避光靜置30min,同樣以上述以1號管為空白,在680nm波長處測定吸光度,測定3次,記錄數(shù)據(jù),取3次數(shù)據(jù)的平均值。將數(shù)據(jù)代入福林酚標準曲線中計算出蛋白濃度,乘以稀釋倍數(shù)算出發(fā)酵液中蛋白質的濃度,再乘以發(fā)酵液的量即得出發(fā)酵液中蛋白質的量,最后除以稱取樣品的量,可以得出樣品中蛋白質的濃度(見圖1)。
圖1 蛋白質標準曲線
2.3.1 .3 多肽的測定[9]
將提取好的發(fā)酵液放入離心管中于轉速10000r/min的離心機中離心10min,上清液倒出備用,取離心好的上清液1.0mL加入30%三氯乙酸1mL,再次在轉速10000r/min離心機中離心10min,取上清液稀釋至一定濃度(測定吸光值在0.2~0.8之間),再分別加入堿性銅溶液5mL,搖勻,靜置10min后,加入福林酚試劑0.5mL,立即混勻,避光靜置30min,同樣以上述以1號管為空白,在680nm波長處測定吸光度,測定3次,記錄數(shù)據(jù),取3次數(shù)據(jù)的平均值。將數(shù)據(jù)代入福林酚標準曲線中計算出多肽的濃度,乘以稀釋倍數(shù)算出發(fā)酵液中多肽的濃度,再乘以發(fā)酵液的量即得出發(fā)酵液中多肽的量,最后除以稱取樣品的量,可以得出樣品中多肽的濃度。
2.3.2 氨基酸的測定[10]
準確吸取離心好的上清液1.0mL,置于200mL燒杯中,加水60mL,插入酸度計,開動磁力攪拌器,用0.05mol/LNAOH標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2,記錄用去氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù)(按總酸計算公式,可以算出發(fā)酵液的總酸含量)。向上述溶液中,準確加入甲醛溶液10mL,混勻。繼續(xù)用0.05mol/L NAOH標準溶液滴定至pH9.2,記錄用去氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù),供計算氨基酸態(tài)氮含量用。
采用對比試驗法,在其他條件不變的情況下,改變菌液中微生物的配比。試驗分別枯草芽孢桿菌:酵母菌、根霉F:根霉G:白腐:里氏木霉:乳酸桿菌=12:8:4:4:1:1:2和枯草芽孢桿菌:酵母菌:根霉F:根霉G=6:2:1:1為條件,待發(fā)酵完成后,對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試驗結果,試驗結果見表1:
表1 菌液配比對降解豆粕的影響
由表1的試驗結果表明,在其他條件不變的情況下,菌液配比對產(chǎn)生大豆肽的影響不同。數(shù)據(jù)顯示,在枯草芽孢桿菌:酵母菌:根霉F:根霉G=6:2:1:1發(fā)酵條件下多肽含量更高,所以試驗結果得出枯草芽孢桿菌:酵母菌:根霉F:根霉G:=6:2:1:1更有利于降解豆粕。
采用對比試驗法,在其他試驗條件不變的情況下,改變復合微生物菌液接種量。試驗分別以復合微生物菌液接種量0mL、12mL、15mL、18mL為條件,待發(fā)酵完成后,對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試驗結果,試驗結果見表2:
表2 復合微生物菌液接種量對降解豆粕的影響
由表2的試驗結果表明:復合微生物菌液接種量對降解豆粕的影響不同。在一定范圍內,隨著菌液接種量的增多,多肽含量也隨之增加,但培養(yǎng)基能夠提供的營養(yǎng)物質和生存空間是有限的,超過一定的范圍并不會增加多肽的含量。在其他條件相同的情況下,與空白組多肽量為29.902mg/g相比較,接種量18mL組多肽量增加了66.179mg/g。接種量18mL時多肽含量最高。根據(jù)試驗結果得出接種量在18mL時為較優(yōu)條件。
采用對比試驗法,改變固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的固液比。試驗分別以固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的固液比(固態(tài):液態(tài)):1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4,1:1.6為條件,待發(fā)酵完成后,對可溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試驗結果。以下為試驗結果,見圖2:
圖2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量對豆粕降解的影響
水分含量對固態(tài)發(fā)酵有著重要影響,水分含量的高低影響培養(yǎng)基的透氣性,從而影響發(fā)酵菌種的生長。由圖2的數(shù)據(jù)變化趨勢表明:隨著固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量的增多,可溶性蛋白和多肽含量先增加后減少,培養(yǎng)基中的固液比(固態(tài):液態(tài))為1:1.2時可溶性蛋白和多肽含量最高。所以根據(jù)試驗結果可得出固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量固液比(固態(tài):液態(tài))在1:1.2時為較優(yōu)發(fā)酵條件。
采用單因素試驗法,在其他條件不變的情況下,改變豆粕發(fā)酵的溫度。試驗分別以發(fā)酵溫度28℃、31℃、34℃、37℃為條件,待發(fā)酵完成后,對可溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試驗結果,試驗結果見圖3:
圖3 發(fā)酵溫度對豆粕降解的影響
由圖3的變化趨勢可知:發(fā)酵溫度在28℃~37℃時多肽和可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢,隨著發(fā)酵溫度的升高,可溶性蛋白和多肽含量增加,發(fā)酵溫度為37℃時達到最高,這可能是因為菌種的生長對溫度要求較高。所以根據(jù)試驗結果可得出發(fā)酵溫度37℃為較優(yōu)發(fā)酵條件。
采用對比試驗法,在其他條件不變的情況下,改變豆粕發(fā)酵的時間。試驗分別以發(fā)酵時間6d、8d、10d、12d為條件,待發(fā)酵完成后,對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試 驗結果,試驗結果見圖4:
圖4 發(fā)酵時間對降解豆粕的影響
由圖4的試驗結果表明:豆粕的發(fā)酵時間長短對降解豆粕的影響不同。隨著發(fā)酵時間的增長,多肽含量也隨之增加,發(fā)酵12 d的多肽含量最高。根據(jù)試驗結果得出發(fā)酵時間為12 d時為較優(yōu)條件。
采用對比試驗法,在其他條件不變的情況下,使發(fā)酵環(huán)境處于密封條件。試驗分別以密封和不密封為條件,待發(fā)酵完成后,對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較,得出試驗結果,試驗結果見表3:
表3 是否密封對降解豆粕的影響
由表3的試驗結果表明:在其他條件不變的情況下,豆粕是否密封對降解豆粕的影響不同。數(shù)據(jù)顯示,發(fā)酵條件在不密封的條件下多肽含量更高,所以試驗結果得出復合微生物更適合于不密封發(fā)酵。
經(jīng)綜合分析總結試驗結果可知:復合微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆肽較好的發(fā)酵條件為菌體的配比為枯草芽孢桿菌:酵母菌:根霉F:根霉G:=6:2:1:1,菌液接種量18 mL;培養(yǎng)基中的固液比(固態(tài):液態(tài))為1:1.2;發(fā)酵溫度37℃;發(fā)酵時間12 d;不密封的環(huán)境。