從ADAM33基因T2位點(diǎn)多態(tài)性分析小兒支氣管哮喘易感性及其嚴(yán)重程度的關(guān)系

李曉, 張磊，湯昱，許春娜

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞組分、細(xì)胞參與的呼吸科疾病[1]，常發(fā)于兒童群體，患兒多有胸悶、流涕、陣發(fā)性咳喘等癥狀，治療不當(dāng)會(huì)引發(fā)煩躁恐懼、大汗淋漓等癥狀，反復(fù)發(fā)作下會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、身心健康不利。有研究表示該病的遺傳易感性較為明顯[2]，常會(huì)出現(xiàn)家族式聚集。隨著克隆技術(shù)、基因技術(shù)的進(jìn)步，目前已發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)具有遺傳易感性。為找出支氣管哮喘與ADAM33 T2位點(diǎn)多態(tài)性有無(wú)相關(guān)性，以為后續(xù)研究提供資料，本文討論如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2017年1月至2019年3月本院收診的支氣管哮喘患兒47例為觀察組，其中男26例，女21例；年齡4～13歲，平均(7.45±0.62)歲；重度哮喘15例，中度17例，輕度15例。同期選取健康體檢兒童47例為對(duì)照組，其中男25例，女22例；年齡3～13歲，平均(7.51±0.59)歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《支氣管哮喘基層診療指南(2018年)》[3]中有關(guān)于支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)。哮喘嚴(yán)重程度：(1)輕度：1周有≥2 d(非每天)出現(xiàn)日間癥狀，且活動(dòng)輕微受限；(2)中度：1周每天均會(huì)出現(xiàn)日間癥狀(非持續(xù))，且活動(dòng)部分受限；(3)重度：1周每天會(huì)持續(xù)出現(xiàn)日間癥狀，且活動(dòng)嚴(yán)重受限[4]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡3～13歲；(3)患兒家長(zhǎng)已完成知情同意書(shū)的簽署流程，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)并發(fā)肺間質(zhì)性疾病、肺結(jié)核、心源性哮喘者；(2)臨床病歷資料未完全獲取者；(3)存在肺部腫塊者。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) (1)檢測(cè)期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件者；(2)患兒家長(zhǎng)主動(dòng)撤回知情同意書(shū)。

1.6 方法 基因組提?。横槍?duì)所有受試患兒，抽取肘靜脈血3 mL，行乙二胺四乙酸抗凝、冷藏保存操作。通過(guò)細(xì)胞裂解液對(duì)樣本進(jìn)行裂解，離心沉淀完成需以蛋白酶K實(shí)施兩次溶解。若溶液仍相對(duì)渾濁，表示其裂解程度一般，需再次實(shí)施有效裂解。酒精洗脫后進(jìn)行離心處理，再對(duì)患兒的DNA濃度、純度作相應(yīng)檢查，最后做好冷藏保存工作。基因組提取后，通過(guò)Labcycler型PCR儀(德國(guó)Sensoquest)進(jìn)行有效PCR反應(yīng)，再行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，主要以限制性內(nèi)切酶NaR1實(shí)施。整體酶切體系中，20 μL總體系包括10×Buffer液2 μL、去離子水7 μL、限制性內(nèi)切酶1 μL以及PCR產(chǎn)物(成功擴(kuò)增)10 μL，于溫箱(37 ℃)中進(jìn)行酶切過(guò)夜處理，電泳時(shí)間維持為30 min，再通過(guò)凝膠成像儀行相應(yīng)保存。已擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物測(cè)序完成后，通過(guò)BLAST軟件(NCBI)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，對(duì)其測(cè)序結(jié)果正確性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 觀察指標(biāo) 評(píng)測(cè)分析兩組平衡定律(Hardy-Weinberg)、T2位點(diǎn)等位基因頻率，觀察其支氣管哮喘嚴(yán)重程度與T2位點(diǎn)多態(tài)性有無(wú)相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；單變量Logistic回歸用于支氣管哮喘與T2基因位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組平衡定律檢驗(yàn)詳情的調(diào)查 T2位點(diǎn)基因頻率上，兩組研究對(duì)象均有較好的群體代表性，均滿足平衡定律(Hardy-Weinberg)。見(jiàn)表1。

表1 兩組平衡定律檢驗(yàn)詳情對(duì)比

2.2 兩組基因頻率分布詳情的調(diào)查 T2位點(diǎn)等位基因中，觀察組A的基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中罹患支氣管哮喘的高危因素是A等位基因增加。見(jiàn)表2。

表2 兩組基因頻率的分布詳情對(duì)比[n(%)]

2.3 哮喘患兒嚴(yán)重程度與其T2位點(diǎn)多態(tài)性的調(diào)查 T2位點(diǎn)等位基因中，重度哮喘患兒AG基因型頻率與中度哮喘患兒比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；重度和中度哮喘患兒AG基因型頻率均高于輕度哮喘患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示支氣管哮喘是否嚴(yán)重的高危因素是AG等位基因增加。見(jiàn)表3。

表3 哮喘患兒嚴(yán)重程度與其T2位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)比

3 討論

支氣管哮喘患兒的發(fā)病因素一般與水產(chǎn)、牛奶、花粉、塵螨、非甾體類抗炎藥、冷空氣、劇烈運(yùn)動(dòng)、呼吸道感染等有關(guān)，是一種發(fā)作時(shí)通常有喘鳴音、呼吸時(shí)間延長(zhǎng)、呼吸困難等癥狀的氣道慢性炎癥疾病[5-6]。支氣管哮喘易感人群的修復(fù)周期較長(zhǎng)，且修復(fù)效率較低，長(zhǎng)時(shí)間處于炎癥狀態(tài)會(huì)引發(fā)氣道重構(gòu)，影響患兒健康[7]。臨床認(rèn)為盡早對(duì)支氣管哮喘的遺傳具體機(jī)制進(jìn)行探索較為關(guān)鍵，ADAM33基因?qū)儆贏DAM基因家族，后者在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、金屬蛋白酶活性調(diào)控、細(xì)胞融合等方面扮演著重要角色，其中金屬蛋白酶活性可破壞肺泡組織結(jié)構(gòu)的完整性，降低各項(xiàng)肺功能指標(biāo)，影響著小兒支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，經(jīng)多年研究與分析，哮喘發(fā)病研究領(lǐng)域中ADAM33的地位得到有效確立[8]?，F(xiàn)階段國(guó)外研究認(rèn)為其T1、M+I、F+I、V4、T2等位點(diǎn)基因多態(tài)性與支氣管哮喘疾病的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)，但由于此次研究涉及遺傳基因，應(yīng)考慮種族人群差異的影響，加之國(guó)內(nèi)漢族人口較多，有研究顯示T2單核酸苷多態(tài)性與漢族支氣管哮喘人群易感性存在相關(guān)性，能夠?qū)h族患病率、病情預(yù)后及死亡率進(jìn)行判斷，故僅對(duì)研究深入性不足的T2位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)性分析[9]。

本文結(jié)果中，T2位點(diǎn)等位基因中，罹患支氣管哮喘的高危因素是A等位基因增加。T2位點(diǎn)主要位于ADAM33基因的第20外顯子上，堿基變化上的C由T代替，進(jìn)而可將氨基酸(第774個(gè))由Pro轉(zhuǎn)換為Ser。支氣管哮喘與該位點(diǎn)的基因多態(tài)性存在相關(guān)性，這與易感人群存在明顯遺傳傾向有關(guān)，種族不一的情況下其所攜帶的基因亦不相同，故大多屬于家族史發(fā)病[9]。于水蓮等[10]研究認(rèn)為ADAM33基因與哮喘癥狀的嚴(yán)重程度存在一定關(guān)系，若哮喘患兒的癥狀越嚴(yán)重，那么ADAM33 mRNA的表達(dá)水平亦會(huì)相應(yīng)上升，這與本文結(jié)果基本一致。本文中該位點(diǎn)的基因多態(tài)性與AG等位基因增加存在明顯相關(guān)性，能夠針對(duì)患兒的支氣管哮喘嚴(yán)重程度進(jìn)行區(qū)別，臨床可基于此做好其對(duì)癥用藥工作，以此提升患兒的診療安全性。本次研究未深入分析T1、M+I、F+I、V4等位點(diǎn)基因與小兒支氣管哮喘易感與嚴(yán)重程度之間的關(guān)系探討，此為本研究不足之處，仍應(yīng)于后期研究中不斷探討其相關(guān)性，以最大限度找出支氣管哮喘發(fā)病與ADAM33基因存在聯(lián)系的具體基因位點(diǎn)，進(jìn)而做好風(fēng)險(xiǎn)防范工作。

綜上所得，支氣管哮喘與ADAM33 T2位點(diǎn)多態(tài)性存在相關(guān)性，其AG基因型頻率、A的基因頻率均會(huì)致使兒童罹患該病，臨床需做好相關(guān)檢測(cè)工作，以便盡早預(yù)防。