miRNAs小鼠哮喘模型中的作用初探

張冬姣，徐浩

哮喘個(gè)體免疫反應(yīng)的改變可歸因于遺傳和表觀遺傳的改變[1-2]。MicroRNAs(miRNAs)是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在發(fā)育和炎癥性疾病中受到不同的調(diào)節(jié)[3-4]。在過敏性氣道疾病中，miRNAs的作用可以明顯影響全身炎癥反應(yīng)和組織反應(yīng)[5]。本研究利用動(dòng)物模型來探討miRNAs在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用，希望進(jìn)一步了解miRNAs在哮喘中的特定作用。

1 材料方法

1.1 動(dòng)物 選取6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g的BALB/c小鼠24只[SYXK(遼)2010-0002]，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、卵清蛋白處理組、地塞米松治療組各8只。

1.2 給藥方法 (1)正常對(duì)照組：在飼養(yǎng)的第1、7、14天使用200 μL含1 mg的氫氧化鋁的磷酸鹽緩沖液(phosphate belanced solution，PBS)作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內(nèi)吸入20 μL的PBS。(2)卵清蛋白處理組：在飼養(yǎng)的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氫氧化鋁的PBS作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內(nèi)吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS。(3)地塞米松治療組：在飼養(yǎng)的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氫氧化鋁的PBS作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內(nèi)吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS，并且給小鼠腹腔注射2 mg/kg的地塞米松。

1.3 肺泡灌洗液的收集 實(shí)驗(yàn)完成后使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，隨后頸椎脫臼法處死小鼠。剖開頸部并暴露氣管，夾住遠(yuǎn)端氣管，將滯留針插入氣管中；使用1 mL注射器吸0.8 mL預(yù)冷的PBS，通過滯留針緩慢注射于肺中，并輕柔按摩肺部10 s后吸出；將兩次收集的灌洗液離心，1 500 r/min，離心10 min，離心半徑6 cm，將上清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待用。

1.4 炎癥細(xì)胞的計(jì)數(shù) 使用血細(xì)胞分析儀分析支氣管肺泡灌洗液中各種炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)、嗜中性粒細(xì)胞(neutrophil，NEU)、巨噬細(xì)胞(macrophage，MAC)和淋巴細(xì)胞(lymphocyte，LYM))的數(shù)量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 使用ELISA試劑盒檢測(cè)肺泡灌洗液中的白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-5和IL-13的表達(dá)水平。加一定稀釋的待檢樣品100 μL于已包被的96孔孔板中，37 ℃孵育1 h。洗滌后加入酶標(biāo)抗體100 μL。37 ℃孵育1 h，洗滌。加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺底物100 μL，37 ℃孵育30 min。終止反應(yīng)，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長下的吸光度。

1.6 標(biāo)本送檢 每組取3只小鼠的肺組織1 cm剪碎，通過1 mL Trizol裂解，使用氯仿、異丙醇抽提獲取總RNA。采用焦碳酸二乙酯水溶解后，送至沈陽匯佰生物科技有限公司進(jìn)行miRNA基因芯片檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR TRIZOL法提取肺組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。所用引物為miR-455，F(xiàn)(5′-3′)：TAA GAC GTC CAT GGG CAT，R(5′-3′)：GTG CAG GGT CCG AGG T；U6，F(xiàn)(5′-3′)：CTC GCT TCG GCA GCA CA，R(5′-3′)：ACG CTT CAC GAA TTT GC。

2 結(jié)果

2.1 哮喘對(duì)于炎癥細(xì)胞的影響 卵清蛋白處理組小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC和LYM高于正常對(duì)照組，地塞米松治療組炎癥細(xì)胞含量低于卵清蛋白處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 炎癥細(xì)胞的表達(dá)情況

2.2 哮喘對(duì)于細(xì)胞因子的影響 見表2。

表2 細(xì)胞因子的表達(dá)情況

表2結(jié)果表明，卵清蛋白處理組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，地塞米松治療組細(xì)胞因子含量低于卵清蛋白處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 哮喘對(duì)于miRNAs表達(dá)情況的影響 卵清蛋白處理組的肺組織中miR-34和miR-155表達(dá)低于正常對(duì)照組，miR-21、miR-455和miR-126表達(dá)高于正常對(duì)照組0.497±0.174，且地塞米松治療后這些miRNAs恢復(fù)到正常水平，見表3。

Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-455在卵清蛋白處理組為0.734±0.090，顯著高于正常對(duì)照組0.497±0.174，地塞米松治療后miR-455基本恢復(fù)到正常水平(0.426±0.256)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.9，P<0.05)。

表3 miRNAs差異性表達(dá)情況

2.4 miR-455與炎癥因子的相關(guān)性 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)指出，miR-455與EOS、NEU、MAC和LYM的表達(dá)均呈正相關(guān)，結(jié)果見圖1。

2.5 miR-455與細(xì)胞因子的相關(guān)性 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)指出，miR-455與IL-4、IL-6和IL-13的表達(dá)均呈正相關(guān)，結(jié)果見圖2。

圖1 miR-455與炎癥因子的相關(guān)性分析

圖2 miR-455與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

3 討論

miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。據(jù)估計(jì)，它們可以調(diào)節(jié)超過60%的蛋白質(zhì)編碼基因。miRNAs通過與靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上的互補(bǔ)同源序列部分結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯或mRNA降解[6]。miRNAs在血液循環(huán)中大量存在，一些miRNAs被認(rèn)為是診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)癌癥及其他疾病治療結(jié)果的有效工具[6]。某些miRNAs被認(rèn)為在哮喘發(fā)病機(jī)制中起作用[7]。研究指出在哮喘發(fā)病過程中，miRNAs通過調(diào)節(jié)Th2的存活、活化、增殖、分化和發(fā)育來控制過敏性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度[8]。一些miRNAs通過靶向銜接蛋白和轉(zhuǎn)錄因子參與了巨噬細(xì)胞激活和極化的調(diào)節(jié)。研究指出，哮喘模型血清中miRNA-29b-3p、miRNA-145-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-147b、miRNA-155、miRNA-193a、miRNA-500a、miRNA-502、miRNA-511下調(diào)，miRNA-147b、miRNA-181a/b上調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1的激活[9]。本研究旨在探討小鼠哮喘模型中異常表達(dá)的miRNAs，希望探討哮喘的發(fā)病機(jī)制，為哮喘的早期診斷和治療提供新的可能。

本研究在構(gòu)建了小鼠哮喘和治療模型后，通過細(xì)胞分析和ELISA方法指出，卵清蛋白處理組肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表達(dá)顯著上調(diào)，地塞米松治療后各種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子與卵清蛋白處理組比較表達(dá)下調(diào)明顯。miRNAs芯片分析結(jié)果指出，多種miRNAs在卵清蛋白處理后出現(xiàn)異常表達(dá)的現(xiàn)象，其中miR-34和miR-155表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，miR-21、miR-455和miR-126存在表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象。這些miRNAs中，miR-155已經(jīng)被證明對(duì)于哮喘的發(fā)生具有調(diào)節(jié)作用[7-8]，本研究中篩選出差異性最為明顯的miR-455目前在哮喘中的作用尚無明確報(bào)道。

miR-455已經(jīng)在多種腫瘤中被證明發(fā)揮重要作用[10-12]，血清miR-455-3p被證明可以作為乳腺癌的生物標(biāo)志物在乳腺癌的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，通過靶向SOCO3促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和侵襲，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的耐藥性和侵襲性。在肺部疾病中轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生miR-455，miR-455可以通過靶向刺激Ago2-IP的富集激活的成纖維細(xì)胞中的TGF-β1和Wnt途徑，促進(jìn)肺部疾病的進(jìn)程[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)miR-455的表達(dá)情況與小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表達(dá)呈正相關(guān)，推斷miR-455可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與哮喘的進(jìn)程。我們推斷哮喘過程中TGF-β1可能通過促進(jìn)miR-455的表達(dá)，促進(jìn)炎癥發(fā)展、加劇哮喘程度。

本研究表明，miR-455在卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中顯著上調(diào)，本研究為哮喘的治療提供了新的可能。