基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制

郝方嘉，彭媛媛，趙琳靜

（上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,上海 201620）

潰瘍性結(jié)腸炎 (Ulcerative Colitis，UC) 是一種由多種因素引起的炎癥性腸病，臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)性或反復(fù)性發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便等[1]，病況反復(fù)遷延，且有癌變風險[2].目前，關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制尚不明確，通常認為與遺傳和環(huán)境因素引起的腸道微生物組成變化和腸黏膜屏障損傷有關(guān).現(xiàn)有的治療藥物主要包括柳氮磺吡啶水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑[3].這些藥物可以暫時緩解癥狀，但是容易引起消化道出血、皮疹、代謝紊亂、白內(nèi)障、青光眼等多種副作用，此外還可能引發(fā)一系列感染.

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)學(xué)“痢疾”范疇.中醫(yī)藥療法在促進腸黏膜恢復(fù)、緩解臨床癥狀、減少復(fù)發(fā)方面有獨特優(yōu)勢.據(jù)文獻報道，在我國有超過20%的潰瘍性結(jié)腸炎患者采用純中藥治療，59%患者采用中西醫(yī)結(jié)合治療[4].Zhao 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，補氣養(yǎng)陰類民間經(jīng)方黃芪?枸杞子藥對可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重、腹瀉及結(jié)腸黏膜損傷，有效促進腸上皮細胞增殖.但由于化學(xué)成分復(fù)雜，關(guān)于黃芪?枸杞子配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制尚未見報道.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) (network pharmacology)[6]是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，從整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的新學(xué)科.相比以往“一個藥物、一種基因、一種疾病”的新藥研發(fā)模式，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為多成分、多靶點、多通路互作的復(fù)雜藥物的作用和機制研究提供了強有力的手段[7].本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)挖掘黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點和相關(guān)信號通路，探討可能的作用機制，為兩藥配伍抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的循證研究提供參考數(shù)據(jù).

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 中藥化學(xué)成分及候選靶點

通過整合藥理學(xué)平臺(Integrative Pharmacologybased Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http://www.tcmip.cn/)[8?9]的“中藥材數(shù)據(jù)庫”“中藥成分數(shù)據(jù)庫”“中藥靶標數(shù)據(jù)庫”“疾病相關(guān)分子庫”等數(shù)據(jù)庫資源，檢索中藥黃芪和枸杞子所有化學(xué)成分及相關(guān)靶點，并收集潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)基因和蛋白靶點，對中藥成分及相關(guān)靶點進行功能分析.以兩倍“節(jié)點連接度”中位數(shù)為卡值，選取中藥成分靶標和疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，根據(jù)“節(jié)點連接度”“節(jié)點緊密度”“節(jié)點介度”3 個拓撲結(jié)構(gòu)特征值，篩選黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵作用靶標.

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫 (http://www.uniprot.org/)對收集的基因信息和蛋白靶點進行校正，物種設(shè)置為 Human，獲得各靶點的Uniprot ID.將上述靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，獲得關(guān)鍵靶點蛋白互作 (Protein-Protein Interactive,PPI) 關(guān)系數(shù)據(jù)，進一步利用 Cytoscape 3.7.1 軟件(https://cytoscape.org/) 構(gòu)建PPI 可視化網(wǎng)絡(luò).

1.3 基因功能和信號通路富集分析

將黃芪?枸杞子配伍調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫 (https://david.ncifcrf.gov/)，設(shè)置物種及背景為Homo sapiens (Human)，進行基因本體(Gene Ontology，GO) 功能富集和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 信號通路富集分析，獲得黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標的基因功能及參與的信號通路.

GO 富集分析主要包括生物過程 (Biological Process，BP)、細胞組成 (Cellular Component，CC)和分子功能 (Molecular Function，MF) 3 個部分，分別按照p值篩選排名前30 位的條目進行分析.KEGG 富集分析按照p值選取排名前 30 位的條目進行分析，并將富集分析結(jié)果可視化.

1.4 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 TCMIP 平臺的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)計算模塊，構(gòu)建“中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘黃芪?枸杞子配伍抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點和主要信號通路.

2 結(jié)果

2.1 黃芪?枸杞子藥對的化學(xué)成分及候選靶標篩選

本研究收集黃芪和枸杞子化學(xué)成分共計89 個.黃芪中29 種化學(xué)成分對應(yīng)基因和蛋白靶點77 個，枸杞子中60 種化學(xué)成分對應(yīng)蛋白靶點229 個，其中，23 種蛋白靶點為兩藥共有靶點.對中藥成分潛在靶標的基因功能進行分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及氧化還原過程、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、L?抗壞血酸結(jié)合、鐵離子結(jié)合、胞外甘氨酸門控氯通道活性、磷脂及磷脂酰膽堿生物合成等.

2.2 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的候選靶標相互作用分析

利用TCMIP 數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)絡(luò)計算技術(shù)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值，篩選黃芪?枸杞子抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的候選靶標，構(gòu)建候選靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示.此網(wǎng)絡(luò)中包含146 個節(jié)點和510 條邊，分別代表候選靶標及其相互作用.節(jié)點大小代表連接度 (degree)大小.表1 顯示了連接度 >10 的23 個關(guān)鍵靶標的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征參數(shù).

表1 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征參數(shù)Table 1 Network topological parameters of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

圖1 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的候選靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Candidate target interaction network of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.3 GO 功能富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對2.2 中描述的關(guān)鍵靶標進行 GO 功能富集分析.以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得BP 相關(guān)條目217 個，CC 相關(guān)條目20 個，以及MF 相關(guān)條目43 個.各取排名前10 位的條目，結(jié)果如圖2 所示.BP 相關(guān)前10 位條目主要涉及凋亡過程負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路等；CC 相關(guān)前 10 位條目主要涉及質(zhì)膜、核質(zhì)等；MF 相關(guān)前10 位條目主要涉及ATP 結(jié)合、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等.

圖2 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標的GO 功能富集分析圖Fig.2 GO network enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.4 KEGG 通路富集分析

對黃芪?枸杞子抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的關(guān)鍵靶標進行 KEGG 通路富集分析，以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得相關(guān)信號通路125 個.按照p值取前30 個重要通路，結(jié)果如圖3 所示.主要涉及趨化因子信號通路、PI3K-Akt 信號通路、JAK/STAT 信號通路、Toll 樣 受 體 (Toll-Like Receptors,TLRs) 信號通路、腫瘤壞死因子 (TNF)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子 (NF-κB) 信號通路、HIF-1信號通路等重要免疫和炎癥相關(guān)通路.此外，也與一些癌癥通路、cGMP-PKG 信號通路、鞘脂類信號通路、雌激素信號通路等有關(guān).

圖3 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標的KEGG 通路富集分析圖Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.5 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎的“中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點?主要通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖4所示.此網(wǎng)絡(luò)中包含40 個節(jié)點和74 條邊，涉及9 個潛在活性成分、11 個作用靶點及18 個信號通路.結(jié)果表明，黃芪?枸杞子藥對活性成分可通過作用于磷脂酶D1/2 (PLD1/2)、前列腺素 G/H 合成酶 1/2 (PTGS1/2)、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARG)、趨化因子CCL8、腺苷A3 受體 (ADORA3) 等關(guān)鍵靶點，參與NF-κB、TNF、趨化因子、T細胞受體 (TCR)、B 細胞受體 (BCR) 等免疫和炎癥相關(guān)重要信號通路，發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎作用.

圖4 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 "Herb-composition-target-pathway" multidimensional network diagram

3 結(jié)語

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分和可能的作用機制，結(jié)果顯示兩藥配伍可能通過調(diào)節(jié)多個免疫和炎癥相關(guān)信號通路發(fā)揮抗UC 作用.黃芪中活性成分毛蕊異黃酮 (Calycosin)、異鼠李素(Isorhamnetin) 等可作用于PTGS2 發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎作用[10]；PTGS2 (COX-2) 是一種可誘導(dǎo)酶，介導(dǎo)前列腺素的合成，在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用.實驗研究證實，黃芪多糖也可減少調(diào)節(jié)核因子-κB (NF-κВ) DNA 磷酸化活性，并下調(diào)腫瘤壞死因子 (TNF-α) 和白介素 (IL-1β,IL-6,IL-17) 等多種炎癥因子表達[11].同時，研究表明枸杞子提取物可降低右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的趨化因子 (C-X-C motif) 配體1 和單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1) 以及炎癥介質(zhì)白介素-6 (IL-6) 和環(huán)氧化酶-2 (COX-2) 表達[12].Sharma 等[13?14]報道了枸杞子提取物通過NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 等信號通路和激酶的表達，抑制腸道炎癥，促進腸黏膜損傷修復(fù).這些研究從不同角度驗證了本研究發(fā)現(xiàn).后續(xù)將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，對篩選出的關(guān)鍵靶點和信號通路繼續(xù)開展細胞及動物水平的實驗驗證，全面揭示黃芪?枸杞子配伍通過調(diào)節(jié)炎癥與免疫治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機制，為中醫(yī)藥抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的基礎(chǔ)和臨床研究提供科學(xué)數(shù)據(jù).