高效液相色譜法測定不同時(shí)間人血漿中帕拉米韋的濃度及臨床觀察

趙曉娟，趙永紅，王淑梅，李浩然，劉秀菊

作者單位：河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊050000

流感是一種由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。在全球范圍內(nèi)，估計(jì)每年有5%～10%的成人及20%～30%2歲以上兒童受到影響，大約每年有2.5～5 萬人死于流感。流感病毒屬于正粘病毒科，為RNA 病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白分為甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2 亞型及乙型流感病毒中的Victoria 和Yamagata系。

抗流感病毒藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)甲型、乙型流感均有效。我國推薦使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑有磷酸奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋。帕拉米韋是第一個(gè)注射用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑，為惡心、嘔吐、吞咽困難、昏迷等一些重癥病人及老人和兒童提供了一種新的給藥途徑。帕拉米韋常見的不良反應(yīng)有消化系統(tǒng)癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測值異常，偶見心血管和神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。消化系統(tǒng)反應(yīng)常見腹瀉、惡心、嘔吐、胃疼等；臨床檢驗(yàn)值異常主要表現(xiàn)為血中網(wǎng)織紅細(xì)胞降低、白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低、中性粒細(xì)胞比降低、淋巴細(xì)胞比升高和甘油三酯升高等。至今為止，國內(nèi)關(guān)于應(yīng)用HPLC 法測定帕拉米韋在人體血漿中不同時(shí)間藥物濃度的文獻(xiàn)報(bào)道較少，但此類文獻(xiàn)可見報(bào)道。而本研究通過測定帕拉米韋給藥后不同時(shí)間人血漿藥物濃度，為建立群體藥代動(dòng)力學(xué)模型提供基礎(chǔ)研究，為臨床安全合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)包括Empower Application 操作平臺(tái)，486 紫外檢測器和515 泵（美國Waters公司）。

帕拉米韋對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，含量98.369%，批號(hào)：C10075504）；甲硝唑（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.9%，批號(hào)：100191-201507）；乙腈為色譜純；三乙胺、甲酸、磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相（水相：有機(jī)相=86：14，V/V）水相：5 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液（0.1%三乙胺），磷酸調(diào)pH 5.0，有機(jī)相：乙腈；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的配制

帕拉米韋儲(chǔ)備液：精密稱取帕拉米韋對(duì)照品10 mg，置10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃保存待用。

帕拉米韋對(duì)照品溶液：取帕拉米韋儲(chǔ)備液適量，分別制備濃度為500、200、100、50、20 和10 μg/mL的帕拉米韋對(duì)照品溶液，4 ℃保存待用。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取甲硝唑?qū)φ掌?0 mg，置100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，制成濃度為0.1 mg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃保存待用。

2.3 血樣預(yù)處理

取人血漿樣品200 μL，置1.5 mL離心管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s，加入乙腈（含0.1%甲酸）800 μL，渦旋混合1 min，離心（6 163×g）5 min，取上清液500 μL，置1.5 mL離心管中，40 ℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑Ｓ辔镆粤鲃?dòng)相100 μL復(fù)溶，渦旋混合1 min，離心（6 163×g）5 min，取上清液。

2.4 方法學(xué)

2.4.1 專屬性 分別將帕拉米韋對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣；空白人血漿（不加內(nèi)標(biāo)）、給藥后15 min 人血漿按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖?？梢娙搜獫{中內(nèi)源性物質(zhì)與帕拉米韋及內(nèi)標(biāo)在該色譜條件下分離良好，不干擾測定。見圖1。

2.4.2 線性試驗(yàn)與最低定量限 分別取帕拉米韋對(duì)照品溶液各20 μL，置1.5 mL塑料離心管中，分別加入空白人血漿180 μL，制得濃度為50、20、10、5、2、1 μg/mL的模擬血漿樣品，均按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測定，以血漿中帕拉米韋的濃度c為橫坐標(biāo)，以帕拉米韋峰面積比內(nèi)標(biāo)峰面積的比值R為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程R=0.032 1c+0.015 7（r=0.999 9）。帕拉米韋在1～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限（LLOQ）為1 μg/mL。

圖1 HPLC色譜圖：A為帕拉米韋對(duì)照品溶液；B為內(nèi)標(biāo)溶液；C為空白人血漿；D為給藥15min后人血漿；E為模擬血樣（空白血人漿、帕拉米韋對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)）

2.4.3 回收率試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高及最低定量限濃度（2，10，40，1 μg/mL）的模擬血樣各5 份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)行測定，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算實(shí)測濃度，與理論濃度之比計(jì)算方法回收率。另外，各樣品分別于1 d 和連續(xù)5 d 測定，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度帕拉米韋回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果/%

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別考察帕拉米韋模擬血樣（2，40 μg/mL）-70 ℃保存5 d、反復(fù)凍融3 次及處理后室溫放置4 h 的穩(wěn)定性，RSD 分別為7.7%、8.4%、5.2%和8.9%、9.2%、7.4%，表明帕拉米韋在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.5 樣本測定

2.5.1 樣本采集 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選擇5例單純性流感病人，有流感癥狀且所有癥狀不超過48 h，發(fā)熱始于48 h 之內(nèi)，流感病毒快速抗原檢測（RAT）陽性，并簽署知情同意書的臨床病人。病人年齡32.8 歲，年齡范圍為18～50 歲，男2 例，女3 例，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）范圍為18～24 kg/m。單次靜脈滴注帕拉米韋氯化鈉注射液300 mg（100 mL），滴注時(shí)間不少于30 min，于給藥前及給藥后15 min，45 min，3 h 由肘靜脈取血，大約3 mL。全血在采集后1 h 內(nèi)，3 000 r/min 離心10 min，分離血漿，于-70 ℃冰箱保存待測。

2.5.2 樣本測定結(jié)果 取5例病人的待測血漿樣品自然解凍，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算帕拉米韋的血藥濃度，結(jié)果顯示，全部樣本均可檢出。見表2。

2.6 臨床觀察

2.6.1 臨床療效 觀察并隨訪5例病人使用帕拉米韋氯化鈉注射液后的發(fā)熱及流感癥狀緩解時(shí)間，結(jié)果見表3。

表2 單純性流感5例不同給藥時(shí)間的血漿中帕拉米韋濃度/（μg/mL）

表3 單純性流感5例發(fā)熱及流感癥狀緩解時(shí)間/h

2.6.2 不良反應(yīng) 在觀察并隨訪5 例病人的過程中，3 號(hào)病人在給藥結(jié)束后0.5 h 發(fā)生胃痛，約2 h 后緩解，嚴(yán)重程度為輕度，可能與使用藥物有關(guān)。

3 討論

本研究首先采用流動(dòng)相5 mmol/L 的磷酸二氫鉀∶乙腈比例86∶14，流速0.8 mL/min，結(jié)果顯示在此比例下，帕拉米韋與內(nèi)標(biāo)能達(dá)基線分離，且血漿中雜質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)也無干擾，后調(diào)流速0.8 mL/min 為1 mL/min，血漿中雜質(zhì)對(duì)帕拉米韋和內(nèi)標(biāo)均無干擾，且其保留時(shí)間更短，出峰更快，可縮短分析的時(shí)間。本研究在建立方法學(xué)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用于臨床血漿樣本的測定，與使用液質(zhì)方法相比，成本更低，更適用于臨床快速分析。

本研究選取了5 例流感臨床病人，對(duì)5 例病人帕拉米韋給藥后不同時(shí)間的血漿藥物濃度做了初步的測定，均可檢出。從結(jié)果來看，藥物在體內(nèi)的血藥濃度與不良反應(yīng)的發(fā)生沒有直接的關(guān)系，可能與用藥的不同個(gè)體有關(guān)。在本次研究的基礎(chǔ)上，可以通過建立群體藥代動(dòng)力學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)臨床對(duì)病人（不同年齡、體重、腎臟功能）的個(gè)體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。帕拉米韋在短時(shí)間內(nèi)能有效緩解病人流感癥狀，雖然樣本量少，但也觀察到了病人不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，為了保障病人的用藥安全，在臨床應(yīng)用帕拉米韋的過程中還是要注意其不良反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)病人進(jìn)行不良反應(yīng)的監(jiān)護(hù)。但由于本研究納入例數(shù)有限，對(duì)于不良反應(yīng)的監(jiān)護(hù)需要更進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。