應(yīng)用于血液檢測的微流控芯片制造工藝及應(yīng)用研究現(xiàn)狀

司朝霞，韓 文

（山東濰坊市立醫(yī)院檢驗科，山東濰坊261021）

0 引言

血液是人體內(nèi)全身循環(huán)流動的組織液體，當人體產(chǎn)生生理或病理性病變時，血液中的組分或物理性質(zhì)會發(fā)生變化[1]，因此血液組分和物理特性檢測對分析人體生理或病理狀態(tài)具有重要意義，且血液檢測也是當前臨床最重要、最常用的診斷依據(jù)[2]。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢驗科血液檢測需要經(jīng)過漫長的排隊等待，且檢測結(jié)果等候時間為幾個小時到幾天不等，醫(yī)生和患者都無法第一時間得到檢測結(jié)果。同時，傳統(tǒng)檢測方法對于血液樣本量有一定要求，過少的血液量無法獲得準確的檢測結(jié)果，往往需要多達幾十毫升的抽血量，這對于體弱、病重患者會造成一定程度的二次傷害。因此，開展少樣品、多項目集成血液檢測技術(shù)的研究具有重要意義[3]。

20世紀八九十年代，微流控芯片技術(shù)開始興起[4-5]，并逐漸在DNA芯片、芯片實驗室、微進樣技術(shù)、微熱力學(xué)技術(shù)等方面得到了發(fā)展[6-7]。其基本原理是利用復(fù)雜的微流道結(jié)構(gòu)和微流控生物芯片調(diào)度控制技術(shù)使血液細胞以一定速度逐一通過給定的流道結(jié)構(gòu)，進行特定的檢驗項目，能夠?qū)崿F(xiàn)小樣本情況下多檢測項目的整合，大大減少血液樣品的需求量，同時也能夠?qū)崿F(xiàn)實時、快速檢測[8]。該技術(shù)可將血液檢驗實驗室中所需要的樣品處理、儀器檢測和人員操作標準化地集成在微小芯片上，并進行封裝和操作簡化，同時結(jié)合微創(chuàng)無菌采血技術(shù)，使得“便攜式”“傻瓜式”和“實時性”血液檢測成為可能[9-10]。微流控芯片技術(shù)屬于分子生物學(xué)、分析化學(xué)、微結(jié)構(gòu)設(shè)計制造等多學(xué)科交叉技術(shù)，當前還處于實驗室或臨床試驗階段，離大規(guī)模普及應(yīng)用還有一定距離，但是其作為一種新型快速模式化檢測手段具有廣闊的研究價值和應(yīng)用前景。本文將對微流控芯片的基本原理、制造工藝以及其在血液檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行分析，并對未來研究趨勢和需要攻克的關(guān)鍵技術(shù)進行展望。

1 微流控技術(shù)的基本原理和優(yōu)勢

微流控技術(shù)是一種以在微納米尺度空間中對流體進行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)[11]，它能將生化實驗室的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本功能縮微到便攜式微小芯片上，實現(xiàn)多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺上的靈活組合、規(guī)模集成，其典型結(jié)構(gòu)及基本原理如圖1所示[12]。微流控是一個涉及了工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、微加工和生物工程等多個領(lǐng)域的新興交叉學(xué)科。

圖1 典型微流控結(jié)構(gòu)和檢測原理圖[12]

結(jié)合當前血液檢測存在的問題和微流控的技術(shù)特點，將微流控技術(shù)引入到血液檢測領(lǐng)域具有如下優(yōu)勢：

（1）樣品和試劑消耗少，成本降低。使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測，降低檢測費用，縮短分析時間。

（2）具有高通量特點[13]。微流控可以設(shè)計成為多流道，通過微流道網(wǎng)絡(luò)可以同時將待檢測樣本分流到多個反應(yīng)單位，同時反應(yīng)單元之間相互隔離，使各個反應(yīng)互不干擾，因此可以根據(jù)需要對同一個樣本平行進行多個項目的檢測。

（3）污染少，檢測誤差小。由于微流控芯片的集成功能，原先在實驗室里需要人工完成的各項操作全部集成到芯片上自動完成，使樣本的污染降低到最低程度。

（4）集成結(jié)構(gòu)小巧、便攜。將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測所需的離心、過濾、混合、反應(yīng)和檢測等功能整合在微型芯片上，通過標準化封裝制備小體積的便攜式檢測設(shè)備，能夠隨身攜帶、快速檢測。

（5）降低了對專業(yè)醫(yī)護人員的依賴性。衛(wèi)生設(shè)施有限的偏遠地區(qū)不具備醫(yī)學(xué)檢測條件，特別是在流行病暴發(fā)時，能夠降低對檢測設(shè)備的依賴，實現(xiàn)實時、實地快速檢測。

2 微流控芯片制造工藝的研究現(xiàn)狀

根據(jù)被控液體形態(tài)，微流控可分為連續(xù)流體（continuous-flow microfluidics）和液滴微流控（droplet microfluidics）[14-17]。實現(xiàn)基于微流控技術(shù)的血液檢測需要首先獲得檢測所需微液流/微液滴，并實現(xiàn)對其精確控制。而微小液流和液滴的產(chǎn)生依賴于微流控系統(tǒng)工程中的微納米結(jié)構(gòu)，因此微流控芯片技術(shù)中非常重要的一方面便是微小結(jié)構(gòu)的高精度加工和微小液流/液滴的可控產(chǎn)生。對于微小結(jié)構(gòu)的精細加工則涉及到眾多光學(xué)加工工藝、精雕加工、三維增材制造等先進技術(shù)領(lǐng)域，已有研究學(xué)者提出了諸多方案，但仍存在結(jié)構(gòu)尺寸過大、構(gòu)型設(shè)計受限嚴重等特征[18]。因此，尋求更高靈活性、低成本、快速實現(xiàn)的微結(jié)構(gòu)制造新工藝是微流控芯片技術(shù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

2.1 刻蝕微納加工技術(shù)

早期的微流道制造器件的主要原材料是硅片、玻璃等，因此蝕刻法是在上述基底上加工微流道的主要技術(shù)手段。隨著基底材料和微納加工技術(shù)的發(fā)展，蝕刻技術(shù)也從傳統(tǒng)的光刻蝕、濕法刻蝕等技術(shù)逐漸衍生出軟光刻、流動刻蝕、激光刻蝕等全新微納加工方法[19-21]。Dendukuri等[20]通過采用基于液滴的流動光刻法，基于微流控裝置進行微流體顆粒制造。該方法可以用于復(fù)雜顆粒的制造，使顆粒能夠具備各種不同的形態(tài)和化學(xué)層次上的各向異性。李曉宇等[22]采用CO2激光器對聚甲基丙烯酸甲脂（polymethyl methacrylate，PMMA）板進行刻蝕制備微流道，結(jié)果表明激光線能量密度與刻蝕微流道寬度兩者關(guān)系呈指數(shù)增長，通過工藝優(yōu)化可以制備出尺寸小于200μm的微流道。Chung等[19]采用激光直寫的方法燒蝕PMMA加工微流道，并分析激光的光斑直徑對微通道寬度、深度的影響。王中旺等[23]也進行了超快激光直寫PMMA制備微流道的燒蝕機理和工藝參數(shù)優(yōu)化研究，其試驗原理及裝置如圖2所示，通過工藝參數(shù)優(yōu)化可以有效避免加工過程中微流道內(nèi)壁區(qū)域殘渣堆積和氣泡隆起現(xiàn)象。

圖2 超快激光直寫PMMA加工微流道示意圖[23]

2.2 微銑加工技術(shù)

近年來，精密微小機床技術(shù)的發(fā)展使得微納結(jié)構(gòu)的機械加工成為可能。利用微銑加工方法可加工出較復(fù)雜的截面形狀，加工后的微流道可直接封裝成為微流道芯片，或作為塑料成形的模板。微銑技術(shù)在微流道加工領(lǐng)域的應(yīng)用大大擴展了基底材料選擇范圍，為微流控芯片提供了更廣闊的材料選擇空間。Wilson等[24]采用機械微加工制造具有復(fù)雜橫截面幾何形狀的微流道。首先使用微型銑削工具在平面金屬表面上制作半圓形圖案母模，然后通過兩步反向成型工藝將微銑削的圖案轉(zhuǎn)移到聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）上，成功制備了筆直的和蛇形的微流道。余劍武等[25]使用精密微銑削方式，在光滑PMMA表面上加工微溝槽、方柱、圓形及橢圓形陣列，并以水滴的接觸角和形狀作為表面疏水性的表征指標，制備并優(yōu)化了微溝槽和橢圓形陣列復(fù)合疏水微納結(jié)構(gòu)。張金峰等[26]設(shè)計了高速微銑削實驗，研究了微溝槽底面表面粗糙度和側(cè)壁殘留毛刺的變化規(guī)律，從理論角度引入了已加工表面的精確形成和質(zhì)量控制機理，為微流道高質(zhì)量加工提供了理論依據(jù)。

2.3 微納結(jié)構(gòu)增材制造

近年來，3D打印技術(shù)已經(jīng)跨越了許多學(xué)科，隨著微納結(jié)構(gòu)3D打印技術(shù)的發(fā)展[27-29]，其在微流控結(jié)構(gòu)中應(yīng)用的優(yōu)勢開始逐漸顯現(xiàn)，例如簡化具有不同高度或懸掛結(jié)構(gòu)的制造以及芯片材料的多樣化，使得設(shè)計具有更好的靈活性，并能更快地制造傳統(tǒng)工藝無法實現(xiàn)的復(fù)雜微流控結(jié)構(gòu)。Nelson等[9]使用熔融沉積建模3D打印技術(shù)制備了具有透明結(jié)構(gòu)且生物相容性優(yōu)良的微流控結(jié)構(gòu)，其流道尺寸最小可達40μm。Bilatto等[30]通過將立體平版印刷3D打印與噴墨打印相結(jié)合，實現(xiàn)了微流控芯片的快速3D打印，并利用該技術(shù)開發(fā)出了實現(xiàn)血漿分離的簡易微流控芯片，該芯片可以集成到醫(yī)療保健/便攜式系統(tǒng)中進行即時診斷。Cairone等[31]通過3D打印技術(shù)制備了PDMS微光流體芯片，該芯片可以在不使用任何外部光學(xué)設(shè)備的情況下，將激光束直接驅(qū)動到微流道中的兩相流中，利用微流體和激光入射角度之間關(guān)系的不斷變化檢測到不同的信號電平。其基本原理[31]如圖3所示。

微流控芯片技術(shù)的發(fā)展實際上很大程度上受制于微納制造技術(shù)，實現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)、器件、系統(tǒng)的生產(chǎn)和組裝對于實現(xiàn)微流控芯片高度集成化和多功能化具有重要意義。因此，微流控芯片技術(shù)發(fā)展必須緊跟微納制造技術(shù)發(fā)展前沿，特別是三維微納結(jié)構(gòu)制造系統(tǒng)的發(fā)展，將先進微納制造技術(shù)納入到微流控芯片的研制中，逐漸實現(xiàn)微流控芯片系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)簡單化、功能集成化和成本低廉化。

圖3 3D打印PDMS微光流體芯片原理圖[31]

3 微流控芯片在血液檢測中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀

隨著微流控芯片技術(shù)在結(jié)構(gòu)加工、流體控制、多功能檢測集成封裝等方面研究的深入，微流控芯片技術(shù)逐漸向功能實現(xiàn)和臨床驗證等方向發(fā)展。近年來，微流控芯片技術(shù)應(yīng)用研究從簡單的血型區(qū)分，到復(fù)雜的腫瘤細胞識別、核酸快速檢測等領(lǐng)域都取得了良好的試驗效果，為未來大規(guī)模臨床應(yīng)用奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

3.1 血液分型和血液疾病的初步篩查

Lin等[3]設(shè)計了一種便攜式和一次性使用的微流控芯片，用于血液分型和血液疾病的初步篩查。該芯片能夠快速識別血型，并對包括貧血和真性紅細胞增多癥在內(nèi)的不同血液疾病進行快速篩查，且每次需要血液樣本僅為1μL。該芯片的基本原理和檢測流程[3]如圖4所示。

圖4 微流控血液檢測芯片基本原理和檢測流程[3]

吳凡等[32]設(shè)計了微流控毛細管電泳系統(tǒng)，該系統(tǒng)適用于Duffy血型基因分型篩選，可用于建立稀有血型庫，解決稀有血型患者緊急輸血問題，提高輸血安全性。該系統(tǒng)的快捷篩選、分析Duffy血型基因型方法對于建立稀有血型獻血者信息檔案具有重要意義。

3.2 腫瘤細胞快速篩查

陳薇等[33]設(shè)計了一種基于細胞大小差異的楔形結(jié)構(gòu)微流控芯片，實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）快速分選和富集，并進行了臨床驗證，結(jié)果表明楔形結(jié)構(gòu)的微流控芯片基本實現(xiàn)了對外周血CTCs的捕獲和鑒定，在臨床上具有很高的應(yīng)用價值。Schütt等[34]設(shè)計了實時阻抗檢測和活細胞亞群分類的超緊湊型納米細胞測試芯片，其基本原理如圖5所示。該芯片結(jié)合基于機器學(xué)習(xí)的算法，生成了特定的數(shù)據(jù)模式以區(qū)分健康的供體和白血病患者，能夠大大改善傳統(tǒng)診斷方法的總成本和時間。

圖5 白血病微流控芯片原理圖[34]

呂松偉等[35]通過將明膠-金納米棒復(fù)合的光熱釋放體系與微流控技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于微米柱芯片的細胞捕獲與光熱定點釋放裝置。通過優(yōu)化捕獲條件，該裝置可以實現(xiàn)高達90%的捕獲效率。由于明膠的溫敏特性和金納米棒的光熱性能，該裝置可以實現(xiàn)生理溫度37℃下細胞群體釋放和近紅外光照選擇性釋放，2種釋放方式的釋放效率和細胞活力均在90%以上。該裝置的全血樣本檢測實現(xiàn)了CTCs的高效捕獲與無損選擇性釋放。

3.3 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸快速檢測

危害全球人類生命健康的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）屬乙類傳染病，是由SARS-CoV-2引起的，主要通過呼吸道飛沫傳播[36-37]。準確診斷COVID-19患病個體并及時進行隔離十分重要，目前核酸檢測方法主要采用開放式熒光定量PCR（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法，但該方法存在一定的局限性，如假陰性率高、人工手動操作煩瑣、存在氣溶膠污染和泄漏風(fēng)險等。張浩等[38]介紹了幾種當前我國應(yīng)用于COVID-19檢測的基于微流控芯片技術(shù)的高通量即時檢驗（point-of-care testing，POCT）產(chǎn)品，其原理是采用RT-PCR技術(shù)檢測樣本中裂解后的RNA，檢測時間為30～80 min，檢測通量為1～80個樣本，配套試劑病毒拷貝數(shù)檢出限為250～330 copies/mL。

杭躍航等[39]設(shè)計了一種基于磁珠法的兩相流液滴微流控芯片（其基本原理如圖6所示），建立了磁珠和液滴在兩相流體系內(nèi)的動力學(xué)模型，并借助有限元仿真平臺對磁珠微團所處環(huán)境進行了磁場仿真，得到不同體積磁珠微團所受的磁力，并進一步分析了磁珠微團、液滴體積、永磁體移動速度對液滴運動狀態(tài)的影響，最終總結(jié)出液滴操縱圖。該芯片包含了樣品提純、擴增和檢測一系列連續(xù)的生化過程，可用于核酸快速檢測。

3.4 其他領(lǐng)域應(yīng)用研究現(xiàn)狀

微流控芯片在快速檢測血液中有害細菌[40-41]、血液凝血特性測試[42]、全血細胞中白細胞分離[43]、HIV快速檢測[44-46]等領(lǐng)域也有豐富的研究成果，部分已經(jīng)進入臨床試驗階段，有望實現(xiàn)后續(xù)大規(guī)模的臨床應(yīng)用。

圖6 兩相流液滴微流控芯片原理圖[39]

Faridi等[40]提出了基于慣性微流控技術(shù)從全血中分離細菌的方法，通過加入顆粒優(yōu)化了流動條件，并實現(xiàn)了5μm顆粒與2μm顆粒的連續(xù)分離，試驗結(jié)果表明從未稀釋的全血樣本中連續(xù)分離細菌的效率可以達到76%。Mena等[42]設(shè)計了用于測量凝血的連續(xù)微流體黏度計，其工作原理是使血液流入微流道中，在設(shè)定壓力下，液滴的長度與所輸送的血液樣本的黏度成反比。Phillips等[46]設(shè)計了一種低成本、便攜式HIV檢測平臺microRAAD（如圖7所示），可以自動檢測全血中HIV的RNA，即使在室溫下放置3周后，該平臺也會自動從全血中分離出HIV-1 RNA，并能夠?qū)ζ溥M行擴增。

4 結(jié)語

微流控檢測技術(shù)的發(fā)展有效促進了現(xiàn)場、即時檢測和精準、個性化醫(yī)療的發(fā)展，大大降低了醫(yī)學(xué)檢測對設(shè)備和專業(yè)人員素質(zhì)的依賴。但當前微流控技術(shù)還不夠完善，在檢測精度、應(yīng)用領(lǐng)域以及成本控制等方面還有很大的局限性，為了使微流控芯片技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域乃至基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的做用，亟須解決以下幾個關(guān)鍵技術(shù)問題：

（1）簡化樣本處理過程，降低檢測人員專業(yè)技術(shù)需求。當涉及實驗步驟多、人工操作煩瑣時，可能會因為人為操作偏差影響檢測精度。因此，微流控芯片封裝應(yīng)力求功能集成化，盡量簡化人為操作環(huán)節(jié)。

（2）提升檢測通量或提高多項目檢測集成程度。根據(jù)不同的應(yīng)用場景提供不同的技術(shù)方案，如針對醫(yī)院提供高通量檢測滿足大批量檢測，針對個人實現(xiàn)多檢測項目的集成。

（3）提升檢測精度和檢測效率。應(yīng)在試劑響應(yīng)速度和精度、檢查項目集成化等方面尋求新的技術(shù)突破，在避免誤診的基礎(chǔ)上實現(xiàn)高效檢測。

（4）開展廣泛臨床驗證，并建立醫(yī)患、檢驗檢疫機構(gòu)認可機制，使醫(yī)院和檢驗檢疫機構(gòu)能夠認可個人檢測數(shù)據(jù)，從而避免重復(fù)檢測，縮短后續(xù)就診時間。

圖7 microRAAD實物圖[46]

微流控芯片技術(shù)的最大產(chǎn)業(yè)化場景是體外診斷，隨著互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療概念的提出和部署，智能化醫(yī)療檢測終端，特別是即時診斷設(shè)備具有廣闊的市場空間。在此背景下，基于微流控芯片技術(shù)的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)工作流程的自動化，同時更能確保品質(zhì)和生產(chǎn)的一致性，很好地滿足互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療發(fā)展對智能化醫(yī)療檢測終端的需求。微流控芯片檢驗技術(shù)離大規(guī)模臨床應(yīng)用還需要一段時間，相信隨著新材料、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，基于微流控的血液檢測技術(shù)必將不斷完善，為實現(xiàn)高通量、低成本、高精度、實時性的血液檢測提供新的技術(shù)方案。