基于熒光原位雜交法剖析窖泥微生物的預(yù)處理?xiàng)l件探究及應(yīng)用

吳冬梅，袁永飛，田殿梅，薛正楷，3，李 進(jìn)，周榮清

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院郎酒學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川 瀘州 646000；4.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，濃香型、醬香型、清香型、米香型白酒是其四大基本香型白酒，其中尤以濃香型白酒銷量最大，占白酒銷量的70%左右[1-2]。泥窖固態(tài)發(fā)酵是濃香型白酒生產(chǎn)的一個(gè)重要特征，窖泥質(zhì)量與濃香型大曲酒質(zhì)量有一定關(guān)系[3]，窖泥微生物的優(yōu)劣直接關(guān)系到白酒產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)質(zhì)老窖才能生產(chǎn)好酒[4-6]，在長期訓(xùn)化過程中，形成了窖泥中獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此認(rèn)識白酒釀造過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)，尤其是定量地認(rèn)識不同種類功能菌體的組成特點(diǎn)及變化規(guī)律，借此了解微生物作用與白酒質(zhì)量的關(guān)系具有重要意義。

目前，研究白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的方法主要有傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離鑒定法、代謝指紋技術(shù)-群落水平生理特征圖譜（community level physiological profiles，CLPPs）、基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法（變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RLFP）及基于磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）的生物標(biāo)記法等方法。如徐占成等[7]采用微生物分離技術(shù)從劍南春天益老號窖泥中選育到1株產(chǎn)己酸能力（18 000 mg/L）較高的菌株，并經(jīng)16S rDNA序列分析和Biolog分析鑒定為生孢梭菌（Clostridium sporogense）；盧振等[8]采用PCR-DGGE技術(shù)分析窖泥細(xì)菌群落，結(jié)果表明，窖泥中4個(gè)優(yōu)勢門類微生物分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacterium）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）；劉琨毅等[9]采用磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法研究不同老熟方法的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在使用窖泥老熟方法的窖泥中，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的含量均隨著釀酒輪次的增加而增加，且微生物含量逐漸趨近于50年以上窖齡窖池窖泥；李俊輝等[10]采用高通量分析研究華北地區(qū)濃香型白酒窖泥樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，解析濃香型白酒不同窖齡窖泥中優(yōu)勢和特征微生物。但以上方法在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的靈敏度、精確性有待提高。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是指以熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與處理后的微生物內(nèi)目標(biāo)序列以堿基互補(bǔ)配對原則雜交，再通過熒光顯微鏡觀察目標(biāo)基因微生物的細(xì)胞形態(tài)、分布以及數(shù)量的可視化技術(shù)[11]，該技術(shù)具有快速、精確、原位以及可動(dòng)態(tài)觀察等特點(diǎn)[12]，能快速、準(zhǔn)確、可視化的研究自然或人工環(huán)境中的微生物個(gè)體。

濃香型白酒釀造微生物的棲息地營養(yǎng)組分復(fù)雜，酸度、乙醇含量高，正是由于樣品復(fù)雜的體系性質(zhì)及微生物群落多樣性，迄今難以客觀、全貌、快速、可視化的定量描述微生物群落結(jié)構(gòu)特征，尤其是窖泥中植物殘?jiān)⒏乘幔╤umic acid，HA）[13]、土壤粒子及礦物質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致自熒光，另外窖泥中較高含量的腐殖酸還會(huì)干擾核酸延伸與雜交[14-15]，影響FISH檢測結(jié)果。本研究以濃香型白酒窖泥為研究對象，優(yōu)化窖泥樣品的預(yù)處理?xiàng)l件，并利用FISH法檢測大腸桿菌（Escherichia coli）和植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）的回收率，驗(yàn)證預(yù)處理?xiàng)l件的可行性。最后在優(yōu)化條件下檢測不同窖齡窖池窖泥樣品中細(xì)菌及古菌的數(shù)量，開發(fā)可視化揭示釀酒微生物群落數(shù)量變遷規(guī)律的方法，為釀酒微生物（尤其是從種的層面上設(shè)計(jì)探針、檢測菌體）群落結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：四川省微生物資源保藏中心；植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）滬1.08：上海市釀造科學(xué)研究所。

細(xì)菌探針EUB338（5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'，5'端cy3標(biāo)記）、古菌探針ARCH915（5'-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3'，5'端cy3標(biāo)記）：上海生工生物有限公司。

窖泥樣品：參考文獻(xiàn)[16]，從瀘州老窖股份有限公司取樣，分別為試驗(yàn)窖池（1年）（窖池編號2108、2121）窖泥、50年窖齡窖池（窖池編號2131、2132）窖泥、100年窖齡窖池（窖池編號1960、1962）窖泥及300年窖齡窖池（窖池編號77、79）窖泥。

1.1.2 試劑

腐植酸、多聚賴氨酸（純度99%）：美國Sigma公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（分析純）：美國Roche公司；抗熒光猝滅封片液：海門碧云天生物技術(shù)有限公司；溶菌酶（酶活＞20 000 U/mg）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX-51熒光顯微鏡、CX31RTSF光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Lambda 25型紫外可見分光光度計(jì)：美國Perkin Elmer公司；TGL16M高速離心機(jī)：湘麓離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃香型白酒窖泥預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

料液比的確定：稱取3.0 g 100年窖齡窖泥于含有約2.0 g波珠（直徑3～5 mm）的滅菌離心管內(nèi)，首次分別以料液比為1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）的樣液比加入無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2），渦旋振蕩混勻，超聲處理30 s（超聲頻率40 kHz、功率100 W），4 ℃、800 r/min條件下離心10 min，收集上清液；將下層沉淀分別以料液比為1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）加入PBS，重復(fù)以上步驟2次。合并3次收集的上清液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入PBS 10 mL重復(fù)洗滌一次并定容到10 mL，采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法[17]測定總菌數(shù)。同時(shí)，計(jì)數(shù)原窖泥樣品的總菌數(shù)，計(jì)算菌體損失率，確定最適樣液比。菌體損失率計(jì)算公式如下：

在此基礎(chǔ)上，依次考察離心轉(zhuǎn)速（400～2 000 r/min）、超聲波分散時(shí)間（0、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，30 s間歇操作）對窖泥菌體損失率的影響，確定最適離心轉(zhuǎn)速及超聲波分散時(shí)間。

Al2（SO4）3添加量的確定：分別取3.0 g 100年窖齡窖池窖泥樣品于含有玻珠的9支無菌離心管中，在首次加入1/2總體積最優(yōu)樣液比的PBS后分別按濃度0、1.67×10-5mol/g窖泥、2.50×10-5mol/g窖泥、3.33×10-5mol/g窖泥、4.17×10-5mol/g窖泥、5.00×10-5mol/g窖泥、6.67×10-5mol/g窖泥、8.33×10-5mol/g窖泥、10.00×10-5mol/g窖泥加入Al2（SO4）3，其余操作按照前述確定的最優(yōu)處理?xiàng)l件進(jìn)行處理，測定總菌數(shù)，并計(jì)算不同Al2（SO4）3添加量時(shí)菌體損失率；同時(shí)參照文獻(xiàn)[18]測定HA含量，并計(jì)算HA去除率，以確定最佳Al2（SO4）3添加量。HA去除率計(jì)算公式如下：

1.3.2 細(xì)菌回收率測定

將一定量處于穩(wěn)定期的E.coli和L.planetarium菌懸液分別加入3 g 100年窖齡窖泥樣品后，以未添加菌體的100年窖齡窖泥樣品為對照，經(jīng)最優(yōu)條件預(yù)處理后，得到菌體沉淀物。參照吳冬梅等[16，19]所述FISH法略微修改表征樣品中的菌體數(shù)量，同時(shí)FISH法分別計(jì)數(shù)E.coli和L.planetarium純菌體的菌體數(shù)量，并計(jì)算添加菌體的回收率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 FISH法在濃香型白酒窖泥樣品中的應(yīng)用

基于細(xì)菌探針EUB338和古菌探針ARCH915，以不同窖齡窖池的窖泥為對象，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行預(yù)處理，多聚甲醛固定后采用FISH測定菌體數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒窖泥預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 料液比的確定

不同料液比對窖泥樣品菌體損失率的影響見圖1。由圖1可知，隨著緩沖液的增加，菌體損失率逐步降低，可能是PBS的增加，在一定程度上降低了樣品懸浮液的黏度，改善了傳質(zhì)環(huán)境及膠體性質(zhì)，使更多菌體釋放到PBS緩沖液中。當(dāng)料液比為1∶16和1∶20（g∶mL）時(shí)，菌體損失率差異不顯著（P＞0.05），分別為22.36%、20.77%，因此，綜合考慮確定最優(yōu)料液比為1∶16（g∶mL）。

圖1 不同料液比對窖泥菌體損失率的影響Fig. 1 Effect of different ratio of material and solution on the cell loss rate in pit mud

2.1.2 離心轉(zhuǎn)速的確定

離心轉(zhuǎn)速對菌體損失率的影響見圖2。由圖2可知，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，菌體損失率逐漸增大，離心轉(zhuǎn)速為400r/min和800 r/min時(shí)，菌體損失率較低，分別為18.30%、24.60%。基于綜合考慮低菌體損失率和盡量去除腐殖質(zhì)等雜質(zhì)的目標(biāo)，故選擇最優(yōu)離心轉(zhuǎn)速為800 r/min。

圖2 不同離心轉(zhuǎn)速對窖泥菌體損失率的影響Fig. 2 Effect of different centrifugal rotation speeds on the cell loss rate in pit mud

2.1.3 超聲波分散時(shí)間的確定

超聲波分散時(shí)間對窖泥樣品菌體損失率的影響見圖3。由圖3可知，超聲處理時(shí)間在0～120 s的范圍時(shí)，隨著超聲處理時(shí)間的延長，從窖泥中解吸的總菌數(shù)略微增多，菌體損失率略微降低，當(dāng)處理時(shí)間為120 s時(shí)菌體損失率最低。但繼續(xù)延長處理時(shí)間，超過150 s后，菌體損失率明顯增加，可能是長時(shí)間超聲處理使其菌體細(xì)胞壁破碎[20]，減少了檢出的總菌數(shù)。因此，為了盡量多的洗出菌體及保持菌體活性，選擇最優(yōu)超聲分散時(shí)間為60 s。

圖3 不同超聲分散時(shí)間對窖泥菌體損失率的影響Fig. 3 Effect of different ultrasonic dispersion time on the cell loss rate in pit mud

2.1.4 Al2（SO4）3添加量的確定

窖泥樣品中加入Al2（SO4）3，可將腐植酸等雜質(zhì)絮凝沉淀除去，減少對探針的干擾，改善FISH的可視化效果[21]。窖泥樣品經(jīng)不同濃度的Al2（SO4）3溶液處理后，窖泥的菌體數(shù)、HA含量、菌體損失率及HA去除率見表1。由表1可知，Al2（SO4）3添加量在0.00～10.00×10-5mol/g窖泥范圍內(nèi)，隨著Al2（SO4）3添加量的增加，除去HA作用增強(qiáng)，菌體損失率也逐漸增大，當(dāng)Al2（SO4）3添加量＞5.00×10-5mol/g窖泥之后，菌體數(shù)較低，HA含量也極低。由于窖泥樣品中的腐植酸、礦物質(zhì)等雜質(zhì)的自發(fā)熒光強(qiáng)烈，嚴(yán)重干擾了真細(xì)菌和古生菌的可視化和定量檢出，結(jié)合HA要有較高的去除率及菌體損失率盡量要少，因此，確定Al2（SO4）3的添加量為4.17×10-5mol/g窖泥。

表1 不同Al2(SO4)3添加量對菌體數(shù)及腐殖酸含量的影響Table 1 Effects of different Al2(SO4)3 addition on microbial number and humic acid contents

2.2 FISH法測定窖泥樣品中細(xì)菌的回收率

將純培養(yǎng)的E.coli、L.planetarium菌體加至窖泥中，采用FISH法測定窖泥樣品中E.coli、L.planetarium的菌體數(shù)，熒光圖見圖4。由圖4可知，與吳冬梅等[16]的研究結(jié)果一致，經(jīng)過預(yù)處理后，菌體在熒光顯微鏡下清晰可辯，窖泥樣品中的腐植酸、礦物質(zhì)等雜質(zhì)的自發(fā)熒光干擾明顯降低；通過對比，可見L.planetarium的菌體個(gè)體較大。采用FISH法檢測E.coli、L.planetarium的菌體數(shù)量，二者菌體的回收率分別為62.50%和55.44%，前者回收率略高，可能是由于該菌是革蘭氏陰性菌，探針更易進(jìn)入菌體，雜交效果較好；還有可能是因?yàn)長.planetarium菌體個(gè)體相對略大可能在低速離心時(shí)菌體損失略大而使得其檢出率略低，這與BOUVIER T等[22]的研究結(jié)果相似。此外，BATTION T J等[23]基于細(xì)菌通用探針EUB338，采用FISH法檢測因時(shí)間而異冰川溪流泥沙沉積物中菌體的檢出率為22%～56%。說明針對窖泥這個(gè)復(fù)雜樣品，該預(yù)處理?xiàng)l件對窖泥微生物的FISH檢測是可行的。

圖4 添加大腸桿菌（A）及植物乳桿菌（B）窖泥樣品微生物熒光圖Fig. 4 Microbial fluorescence of the pit mud samples with Escherichia coli (A) and Lactobacillus planetarium (B) addition

2.3 FISH法檢測不同窖齡窖池窖泥微生物數(shù)量的結(jié)果

不同窖齡窖泥微生物的FISH檢測結(jié)果見圖5及表2。

圖5 不同窖齡窖泥樣品微生物熒光圖Fig. 5 Microbial fluorescence of different pit age

表2 FISH法檢測不同窖齡窖泥樣品中菌體量Table 2 Number of cells in different pit mud samples detected by FISH×108個(gè)/g

由圖5可知，窖泥樣品經(jīng)Al2（SO4）3處理后，菌體可辨，菌體呈桿狀、螺旋狀及球狀。由表2可知，隨著窖齡的增加，窖泥樣品中細(xì)菌、古菌及菌體總數(shù)總體均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，且基本上在100年窖齡窖池窖泥中達(dá)到最高，而在1年窖齡窖池窖泥中菌體量最少，總菌數(shù)僅為1×108個(gè)/g左右，這可能是菌體在特定環(huán)境中逐漸馴化的結(jié)果。這與一些文獻(xiàn)中的結(jié)論是較吻合的，如岳元媛等[24]利用平板涂布可培法研究瀘州老窖不同窖齡窖泥樣品中兼性厭氧細(xì)菌數(shù)量，得出新窖泥中微生物數(shù)量較老窖泥低；胡承等[25]研究不同窖齡窖泥樣品中微生物數(shù)量，結(jié)果表明老窖泥中的厭氧異氧菌、甲烷菌、己酸菌及硫酸鹽還原菌的數(shù)量都比新窖泥中多；余有貴等[26]研究湖南湘窖酒業(yè)不同窖齡窖泥樣品（0年、2年、16年、33年），結(jié)果表明微生物各類群總數(shù)呈上升趨勢。

3 結(jié)論

本研究確定窖泥樣品的最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件為料液比1∶16（g∶mL）、離心轉(zhuǎn)速800 r/min、超聲分散時(shí)間60 s、Al2（SO4）3添加量為4.17×10-5mol/g窖泥。在此條件下，將E.coli、L.planetarium培養(yǎng)物分別添加到窖泥樣品中，采用FISH法檢測到兩種菌的菌體回收率分別為62.50%和55.44%，說明該條件對于窖泥這個(gè)復(fù)雜樣品的FISH檢測是可行的，可以提高總菌數(shù)的檢出量、準(zhǔn)確性和減少窖泥自熒光的干擾，顯著改善FISH可視化效果。采用優(yōu)化后的條件對不同窖齡窖池窖泥進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)用FISH法研究窖泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，隨著窖齡的增加，窖泥樣品中細(xì)菌、古菌及菌體總數(shù)差異明顯，總體呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，基本上呈現(xiàn)出在100年窖齡的窖泥樣品中，微生物總量最高。