基于高通量測(cè)序技術(shù)分析漢中地區(qū)泡菜水細(xì)菌多樣性

陳 佩，劉 瑩，翟彩寧，黨 輝*

（1.陜西開(kāi)放大學(xué)中瑞旅游與酒店管理學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西開(kāi)放大學(xué)信息與智能技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710119；3.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

泡菜作為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，廣泛分布于我國(guó)的華中、華北和東北等地區(qū)，因其味道酸甜、色澤鮮亮且口感脆生而深受廣大人民的喜愛(ài)[1]。陜西泡菜又稱為“陜西浸菜”，其制作工藝也相對(duì)簡(jiǎn)單，主要以當(dāng)?shù)氐睦苯?、豇豆和蘿卜等蔬菜為原料，并輔以食鹽、生姜、八角和花椒等香辛料混合發(fā)酵而成[2]。漢中地處秦嶺山地和大巴山地的過(guò)渡地帶，位于陜西省西南部，陜甘川三省交匯處。因其獨(dú)特的地理環(huán)境和文化背景賦予了發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味。一項(xiàng)針對(duì)陜西省安康市泡菜水中細(xì)菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)其包含獨(dú)特的微生物群落[3]。蔬菜發(fā)酵不僅能有效延長(zhǎng)其貯藏期，賦予其獨(dú)特的口感和風(fēng)味[4-5]，還能有效提升其產(chǎn)品價(jià)值[6]。相關(guān)報(bào)道顯示，發(fā)酵期間微生物的生長(zhǎng)代謝直接影響著泡菜的品質(zhì)[7]。泡菜開(kāi)始發(fā)酵之前，通常會(huì)加入老鹵作為“引子”加速泡菜的發(fā)酵進(jìn)程[8]，且長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)使用的老鹵能賦予泡菜特殊的風(fēng)味品質(zhì)[9]。近年來(lái)，科研人員系統(tǒng)的解析了不同地區(qū)泡菜中微生物的多樣性[10]，結(jié)果顯示，乳酸菌為泡菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)于泡菜的滋味具有重要的貢獻(xiàn)[11]。值得注意的是，泡菜水作為泡菜發(fā)酵的主要場(chǎng)所，含有大量的乳酸菌，直接或間接影響著泡菜的品質(zhì)[12]，但目前關(guān)于泡菜的研究大多基于泡菜本身，而忽略了泡菜水在發(fā)酵過(guò)程中的重要作用。因此，針對(duì)泡菜水中微生物多樣性的研究是十分必要的。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和大數(shù)據(jù)分析的普及，以Illumina MiSeq為代表的第二代測(cè)速技術(shù)憑借其通量高、精度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物多樣性的解析[13-14]。相較于傳統(tǒng)微生物手段，高通量測(cè)序技術(shù)能不依賴于微生物的純培養(yǎng)，對(duì)環(huán)境中微生物的構(gòu)成和多樣性進(jìn)行全面的解析。目前，其已廣泛應(yīng)用于泡菜[15]、白酒[16]和乳制品[17]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物解析中。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序?qū)h中泡菜水中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)等手段探討了漢中泡菜水中微生物結(jié)構(gòu)的差異，以期為后續(xù)泡菜工藝的改良和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

泡菜水樣本均采集自陜西省漢中市（33°04′03″N，107°01′24″E）下轄的農(nóng)戶家中，共計(jì)30份，編號(hào)分別為P1～P30。泡菜水的制作時(shí)間均在2020年九月中旬到十月中旬左右，所有農(nóng)戶在制作泡菜時(shí)，均添加了“老鹵”作為引子進(jìn)行發(fā)酵，且所有的泡菜原料均為豇豆和辣椒。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFlyDNAPolymerase和脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物338F/806R：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)Dell公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

使用無(wú)菌采樣勺從攪拌均勻的泡菜壇中取400 mL漢中泡菜水于無(wú)菌采樣瓶中，分別對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)后，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測(cè)序

參照基因組試劑盒中提供的方法對(duì)漢中泡菜水中的宏基因組DNA進(jìn)行提取，并依照王玉榮等[18]的方法進(jìn)行16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增。將檢驗(yàn)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

依照雙端序列的重疊關(guān)系對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行拼接，并依照郭壯等[3]的質(zhì)控條件對(duì)合并序列進(jìn)行質(zhì)控，從而獲得高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析?；赒IIME平臺(tái)對(duì)漢中泡菜水中細(xì)菌組成和多樣性進(jìn)行分析，其具體流程參照HOU Q等[19]的方法對(duì)細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。

1.3.4 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用聚類分析對(duì)泡菜水進(jìn)行分組分析；基于非加權(quán)和加權(quán)Uni-Frac距離對(duì)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析；使用Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)不同聚類中泡菜水的α多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異性分析；使用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和可視化；使用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜水樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的分析

使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)漢中泡菜水中細(xì)菌菌群的構(gòu)成進(jìn)行分析，共產(chǎn)生1 395 532條高質(zhì)量序列，平均每份泡菜水可獲得46 518條序列。劃分和刪除單序列操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）后，共得到9 172個(gè)OTU用于后續(xù)分析。泡菜水樣品中的細(xì)菌菌群主要隸屬于24個(gè)門(mén)的553屬。將相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌門(mén)（屬）定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)（屬），基于門(mén)水平，30份泡菜水樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 基于門(mén)水平漢中地區(qū)泡菜水樣品中細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of bacterial community of Paocai brine samples in Hanzhong area based on phylum level

由圖1可知，漢中泡菜水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)有2個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），其平均相對(duì)含量分別為89.12%和7.89%。值得注意的是，變形菌門(mén)僅在少量泡菜水樣品中相對(duì)含量較高，而在大部分泡菜水樣品中相對(duì)含量較低，甚至不存在。由此可見(jiàn)，泡菜水中的細(xì)菌主要隸屬于厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，且其相對(duì)含量存在較大差異。郭壯等[3]對(duì)陜西省安康市泡菜水中微生物多樣性的解析發(fā)現(xiàn)，安康泡菜水中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)（Actinobacteria），其結(jié)果與本研究存在一定的差異。在此基礎(chǔ)上，本研究基于屬水平對(duì)泡菜水中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于屬水平漢中地區(qū)泡菜水樣品中細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of bacterial community of Paocai brine samples in Hanzhong area based on genus level

由圖2可知，漢中地區(qū)泡菜水中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有4個(gè)，分別為片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc），其平均相對(duì)含量分別為52.06%、31.40%、4.89%和1.83%。由圖2亦可知，漢中泡菜水中的細(xì)菌大多隸屬于乳酸菌，且乳酸菌的累計(jì)平均相對(duì)含量＞85%。安康市和漢中市兩地泡菜水中細(xì)菌菌群構(gòu)成較為相似，但優(yōu)勢(shì)菌屬的組成和相對(duì)含量存在一定的差異。相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，泡菜的制作工藝和制作環(huán)境等均會(huì)影響泡菜水中微生物的構(gòu)成[20-21]。

目前，相關(guān)研究已證實(shí)了泡菜中的主要細(xì)菌構(gòu)成為乳酸菌，其對(duì)于泡菜的發(fā)酵和品質(zhì)具有重要的作用[8]。乳酸菌能利用碳水化合物產(chǎn)乳酸，其可以將泡菜體系中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生乙醇、乙酸和二氧化氮等揮發(fā)性物質(zhì)。其不僅可以賦予泡菜制品獨(dú)特的口感和風(fēng)味，還能抑制雜菌和有害菌的生長(zhǎng)以確保食品品質(zhì)的安全[22]。片球菌屬和乳桿菌屬作為漢中泡菜水中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)于其品質(zhì)亦具有重要的作用。相關(guān)研究表明，動(dòng)物和植物來(lái)源的片球菌屬能利用碳水化合物產(chǎn)生不同的非揮發(fā)性和揮發(fā)性物質(zhì)，且非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與香氣具有顯著相關(guān)性，有助于提升發(fā)酵制品的感官特性[23]；而乳桿菌屬作為發(fā)酵制品中最常見(jiàn)的菌屬之一，能顯著改善發(fā)酵制品的口感和風(fēng)味[24]。

2.2 泡菜水樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較

通過(guò)對(duì)泡菜水樣品中細(xì)菌菌群組成分析發(fā)現(xiàn)，漢中泡菜水樣品中細(xì)菌菌群組成之間存在較大的差異。因此，本研究為探究漢中泡菜水中細(xì)菌的整體結(jié)構(gòu)，基于屬水平對(duì)泡菜水樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于屬水平漢中地區(qū)泡菜水樣品的聚類分析結(jié)果Fig. 3 Results of cluster analysis of Paocai brine samples in Hanzhong area based on genus level

當(dāng)K值為2時(shí)，聚類效果最好（CH指數(shù)為65.8），即全部泡菜水樣本可明顯劃分為2個(gè)聚類。由圖3可知，30份泡菜水樣品可以被劃分為兩個(gè)聚類，其中隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品有16份，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品有14份。通過(guò)對(duì)不同聚類中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水中以乳桿菌屬和假單胞菌屬為主，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水中以片球菌屬和乳桿菌屬為主。為進(jìn)一步對(duì)兩組泡菜水中細(xì)菌菌群的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，本研究基于加權(quán)和非加權(quán)的Uni-Frac距離對(duì)兩組泡菜水樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 基于非加權(quán)（a）和加權(quán)（b）Uni-Frac距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig. 4 Principal coordinate analysis results based on unweighted (a)and weighted (b) Uni-Frac distance

由圖4可知，基于非加權(quán)的主坐標(biāo)分析中，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品在空間分布上具有明顯的分離趨勢(shì)，其中隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品主要集中在空間的對(duì)角線上，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品則主要集中在空間的右上角。經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異極顯著（P＜0.01）。由圖4亦可知，基于加權(quán)的主坐標(biāo)分析中，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品廣泛分布在空間的各個(gè)部分，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品具有較高的收斂性，且全部位于聚類Ⅰ的95%置信區(qū)間內(nèi)，經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)兩組泡菜水樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品可能均各自存在一些相對(duì)含量較低，但均為獨(dú)特的細(xì)菌類群。但總體來(lái)說(shuō)，漢中泡菜水樣品的主要細(xì)菌類群是相同的，且隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品中主要細(xì)菌類群較為多元化，而聚類Ⅰ的泡菜水樣品中細(xì)菌類群較為單一。在對(duì)β多樣性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，本研究同時(shí)對(duì)漢中泡菜水樣品的4種α多樣性指數(shù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同聚類的泡菜水樣品的α多樣性指數(shù)比較結(jié)果Fig. 5 Comparison results of α diversity index of Paocai brine samples belonging to different clusters

由圖5可知，經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隸屬于不同聚類泡菜水樣品中的細(xì)菌類群在Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)上均不具有顯著性差異（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，漢中地區(qū)泡菜水樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度較為均一。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在兩聚類泡菜水樣品中的相對(duì)含量進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同聚類的泡菜水樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的比較Fig. 6 Comparison of relative content of dominant bacteria genus in Paocai brine samples belonging to different clusters

由圖6可知，漢中泡菜水中的4個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，有2個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05），其分別為片球菌屬和乳桿菌屬。由圖6亦可知，片球菌屬在聚類Ⅰ中的相對(duì)含量顯著低于聚類Ⅱ（P＜0.05），而乳桿菌屬在聚類Ⅰ中的相對(duì)含量顯著高于聚類Ⅱ（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，盡管片球菌屬和乳桿菌屬作為漢中泡菜水中的主要菌屬，但其相對(duì)含量存在顯著差異，這可能也是導(dǎo)致漢中泡菜水隸屬于兩個(gè)聚類的重要原因之一。

近年來(lái)，關(guān)于發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的同一發(fā)酵食品中微生物的構(gòu)成存在一定的差異，且相距越遠(yuǎn)，差距越大。對(duì)照采樣信息發(fā)現(xiàn)，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品大多采集自漢中地區(qū)的三個(gè)農(nóng)村中，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品幾乎全部來(lái)自于同一個(gè)村落中。這可能是導(dǎo)致漢中泡菜水中隸屬于兩個(gè)聚類的主要原因之一。而值得注意的是，聚類Ⅰ中的極個(gè)別樣品并不屬于那三個(gè)村落中，而這有可能是由泡菜的種類所導(dǎo)致的。相關(guān)研究顯示，蔬菜（蘿卜、辣椒和豇豆等）表面存在大量的乳酸菌[25]，且不同的蔬菜表面存在的乳酸菌種類亦存在一定的差異，而這亦可能影響泡菜水中乳酸菌的種類和含量。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)陜西省漢中市泡菜水樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果表明，漢中地區(qū)泡菜水中的細(xì)菌主要隸屬于24個(gè)細(xì)菌門(mén)的553個(gè)細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），其平均相對(duì)含量分別為89.12%和7.89%；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc），其平均相對(duì)含量分別為52.06%、31.40%、4.89%和1.83%?；趯偎竭M(jìn)行主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，所有漢中泡菜水樣品可以劃分為兩個(gè)聚類；經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隸屬于不同聚類泡菜水樣品的α多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異（P＜0.05），且片球菌屬和乳桿菌屬的相對(duì)含量存在顯著差異（P＜0.05）。同時(shí)，不同聚類的泡菜水樣品中均存在一些低豐度物種，且這些低豐度物種均為一些較為獨(dú)特的細(xì)菌類群。