植物乳桿菌BLPC002產苯乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃國昌，顧斌濤，于一尊，熊大維*，章帥文

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.江西省科學院，江西 南昌 330096）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）也稱為2-羥基-3-苯基丙酸或β-苯乳酸，是一種天然有機酸，普遍存在于雪蓮花、天麻等多種植物和蜂蜜、發(fā)酵牛奶等食品中[1-2]。經研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸是一種廣譜抑菌性強的生物活性化合物，具有抑制蠟樣芽胞桿菌[3]、糞腸球菌[4]、單核細胞增多性李斯特菌[5]等革蘭氏陽性細菌，大腸桿菌[6]、陰溝腸桿菌[7]、腸道沙門氏菌[8]等革蘭氏陰性細菌和黃曲霉[9]、羅氏青霉[10]、黑曲霉[11]等真菌的能力。作為天然的抑菌劑，由于其具有穩(wěn)定性強、安全、無害等特點，在食品防腐劑或飼料添加劑等方面具有巨大的應用潛力[12]。

隨著苯乳酸應用潛力的不斷挖掘[13-15]，生物發(fā)酵法生產苯乳酸的研究越來越受到重視，提高苯乳酸的產量一直是國內外研究的熱點。其中，研究苯乳酸的發(fā)酵工藝是提高苯乳酸產量的重要途徑之一。WU W Y等[16]對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵條件和生長營養(yǎng)物質進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的樣品產苯乳酸的能力是優(yōu)化前的7.61～13.26倍。張成林等[17]利用植物乳桿菌AB-1在優(yōu)化培養(yǎng)基中外源添加酵母菌無細胞發(fā)酵上清液，使苯乳酸產量相較于優(yōu)化前增加了60.3%。侯楠楠等[18]在植物乳桿菌BLCC2-0069培養(yǎng)基中添加苯丙酮酸后，發(fā)酵液中苯乳酸產量是未添加的3倍。劉周玭等[19]優(yōu)化重組大腸桿菌的培養(yǎng)條件后，底物苯丙氨酸轉化為苯乳酸的轉化率為35.2%。李芬等[20]使用亞硝基胍-紫外復合誘變植物乳桿菌LY-78，誘變后苯乳酸產量比誘變前提高了2.89倍。

響應面法因具有準確性高、工作量少和周期短等特點，可以達到提高生產效益的目的[21-22]。本研究以前期研究室篩選得到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002[23]為生產菌，首先對菌株BLPC002生長曲線進行測定，確定該菌株的接種種齡和培養(yǎng)方式，并通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計對植物乳桿菌株BLPC002產苯乳酸的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。旨在降低生產成本，提高苯乳酸產量，為下一步中試研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002：本實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、瓊脂（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯乳酸、苯丙氨酸標準品（純度均為98%）：德國Sigma公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：德國Merck公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，吐溫-80 1.0g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2。121 ℃滅菌20 min。

保藏培養(yǎng)基采用MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上添加瓊脂20.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[24]：苯丙氨酸8.3 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉1.8 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖30.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，吐溫-80 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO4·7H2O 0.25 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀（配有紫外-可見光吸收光譜（ultraviolet-visible spectroscopy，UV/VIS）檢測器和Empower 3色譜工作站）、Waters SymmetryRC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Waters公司；UV-6100紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZWY-2102C恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；NC-MY40超純水機：重慶隆暾科技有限公司；Biostat A全自動發(fā)酵罐：德國賽多利斯集團。

1.3 方法

1.3.1 接種種齡和培養(yǎng)方式的確定

將斜面培養(yǎng)菌種用無菌水洗下后，以2%接種量（V/V）接入裝液量為100 mL/500 mL種子培養(yǎng)基中，置于搖床中30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定菌體濃度（OD600nm值）和苯乳酸產量，同時對比厭氧（采用不間斷通入高純氮氣）振蕩培養(yǎng)（30 ℃，200 r/min）的菌體生長情況，根據測定結果，確定最佳接種種齡和培養(yǎng)方式。

1.3.2 菌株BLPC002產苯乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

接種量對苯乳酸產量的影響：按1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%（V/V）的接種量將種子液接入裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床中30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，檢測發(fā)酵液中苯乳酸產量，以確定適宜接種量。

發(fā)酵時間接種量對苯乳酸產量的影響：將種子液按3%的接種量接入裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床中30 ℃、200 r/min分別振蕩培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，檢測發(fā)酵液中苯乳酸產量，以確定適宜發(fā)酵時間。

發(fā)酵溫度對苯乳酸產量的影響：將種子液按3%的接種量接入裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃搖床中，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，檢測發(fā)酵液中苯乳酸產量，以確定適宜的發(fā)酵溫度。

裝液量對苯乳酸產量的影響：將種子液按3%的接種量分別接入裝有100 mL、125 mL、150 mL、175 mL、200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于搖床中30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，檢測發(fā)酵液中苯乳酸產量，以確定適宜的裝液量。

搖床轉速對苯乳酸產量的影響：將種子液按3%的接種量接入裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃搖床中，分別于100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，檢測發(fā)酵液中苯乳酸產量，以確定適宜的培養(yǎng)轉速。

（2）響應面試驗

以單因素試驗結果為依據，采用Box-Behnken試驗設計，以苯乳酸產量為響應值（Y），選擇接種量（A）、搖床轉速（B）、裝液量（C）和發(fā)酵溫度（D）為響應面分析的自變量因素，對菌株BLPC002發(fā)酵產苯乳酸工藝條件進行優(yōu)化。響應面試驗因素及水平見表1。

表1 產苯乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for optimization of fermentation process of phenyllactic acid production

1.3.3 分析檢測

菌體濃度的測定：采用分光光度法。將發(fā)酵液稀釋至適當濃度后，于波長600 nm處測定其光密度（optical density，OD600nm）值。

苯乳酸的測定：采用高效液相色譜法。參考黃國昌等[25]的方法，WatersSymmetryRC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫30 ℃，進樣量10.0 μL，流速1.0 mL/min，流動相：A相為0.05%三氟乙酸甲醇溶液（V/V），B相為0.05%三氟乙酸溶液（V/V），洗脫程序：0～20 min為A：B由10%線性變化為100%，20～23 min為100%A相，23～25 min保持A：B為10%，檢測波長：210 nm。

苯乳酸標準溶液的配制：準確稱取苯乳酸標品0.100 0 g，用超純水溶解后定容至100 mL，配制成1.000 0 g/L的苯乳酸標準溶液。然后從中分別吸取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL用超純水定容至10.0 mL，分別配制成0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L和0.5 g/L的苯乳酸標準溶液，備用。

發(fā)酵液樣品的預處理：取發(fā)酵液5.0 mL，10 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后即為待測樣品。

定性分析：按上述色譜條件分別將苯乳酸標準溶液和發(fā)酵液樣品進樣分析，對比樣品中各組分與標準品的出峰保留時間，確定樣品中是否含有苯乳酸。

定量分析：將上述各濃度梯度的標準溶液分別進樣分析后，以標準溶液質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標建立外標校正曲線，再根據樣品的峰面積自動計算出樣品中苯乳酸的含量。

2 結果與分析

2.1 接種種齡和培養(yǎng)方式的確定

好氧和厭氧條件下菌株BLPC002的生長曲線見圖1。由圖1可知，菌株BLPC002的生長過程是典型的分批培養(yǎng)過程中微生物的生長過程，經歷了延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰老期四個階段。其中，發(fā)酵時間在0～12 h之間為延滯期，菌體量增長緩慢，主要合成新的酶和細胞增殖所需的各類物質；發(fā)酵時間在12～24 h之間為對數(shù)生長期，細胞大量增殖，菌體量增長迅速；發(fā)酵時間在24～48 h之間為穩(wěn)定期，產物合成速率加快，但持續(xù)時間較短，可能由于葡萄糖的消耗等原因，pH迅速下降，導致菌體內有害產物積累，進入衰亡期。因此，選用對數(shù)生長期24 h左右為最佳接種種齡，該生長曲線也為發(fā)酵周期的選擇提供了一定的參考價值。此外，好氧條件下的菌體生長速度明顯高于厭氧條件。培養(yǎng)結束后，對培養(yǎng)液中的苯乳酸產量進行測定發(fā)現(xiàn)，厭氧條件下苯乳酸產量均值為0.689 g/L，而好氧條件下苯乳酸產量均值為0.306 g/L，說明厭氧條件有利于苯乳酸的合成，因此，考慮采用兼性厭氧的方式進行苯乳酸的發(fā)酵生產，即前24 h內采用好氧方式進行菌體培養(yǎng)，后24 h采用厭氧方式生產苯乳酸。

圖1 好氧和厭氧條件下菌株BLPC002的生長曲線Fig. 1 Growth curves of strain BLPC002 under aerobic and anaerobic conditions

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 接種量對苯乳酸產量的影響

接種量對苯乳酸產量的影響見圖2。由圖2可知，接種量對苯乳酸的產量存在較明顯的影響。在一定范圍內，隨著接種量在1%～3%范圍內的增加，苯乳酸產量也隨之增加；當接種量為3%時，苯乳酸產量為2.11 g/L；當接種量在3%～5%范圍內時，苯乳酸的產量趨于平穩(wěn)，不再有明顯的增長；而當接種量＞5%時，苯乳酸產量出現(xiàn)了下降的趨勢。這可能是因為當接種量較高時，菌種大量繁殖，但營養(yǎng)物質供應不足，導致苯乳酸產量下降。因此，選擇接種量3%為響應面試驗優(yōu)化的中心點。

圖2 接種量對苯乳酸產量的影響Fig. 2 Effect of inoculum on phenyllactic acid production

2.2.2 發(fā)酵時間對苯乳酸產量的影響

發(fā)酵時間對苯乳酸產量的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間在24～48 h范圍內的增加，苯乳酸產量增幅明顯；當發(fā)酵時間為48 h時，苯乳酸產量為2.10 g/L；發(fā)酵時間超過48 h后，再延長發(fā)酵時間，苯乳酸產量變化趨于平穩(wěn)。因此，選擇發(fā)酵時間48 h為響應面試驗優(yōu)化的中心點。

圖3 發(fā)酵時間對苯乳酸產量的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on phenyllactic acid production

2.2.3 發(fā)酵溫度對苯乳酸產量的影響

發(fā)酵溫度對苯乳酸產量的影響見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度在28～34 ℃范圍內的增加，苯乳酸產量增加；當發(fā)酵溫度為34 ℃時苯乳酸產量達到最高值，為2.33 g/L；當發(fā)酵溫度高于34 ℃時，苯乳酸產量急劇下降。其原因可能是，溫度過低或過高對菌體生長和代謝合成所需的酶活性都具有不利的影響，導致苯乳酸合成受阻[26]。因此，選擇發(fā)酵溫度34 ℃為響應面試驗優(yōu)化的中心點。

圖4 發(fā)酵溫度對苯乳酸產量的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on phenyllactic acid production

2.2.4 裝液量對苯乳酸產量的影響

裝液量對苯乳酸產量的影響見圖5。由圖5可知，當裝液量為100～150 mL/500 mL時，苯乳酸產量逐漸增加；當裝液量為150 mL/500 mL時，苯乳酸產量最高2.27 g/L；當繼續(xù)增加裝液量，苯乳酸產量呈下降趨勢。其原因可能是，裝液量的多少不僅會影響菌體生長過程中所需的溶氧量，還會影響發(fā)酵液中營養(yǎng)物質的傳遞，從而影響苯乳酸的合成[27]。適當增加裝液量有利于菌體的生長，而當裝液量過多時，發(fā)酵液的傳質受到影響，導致苯乳酸產量下降。因此，選擇裝液量150 mL/500 mL為響應面試驗優(yōu)化的中心點。

圖5 裝液量對苯乳酸產量的影響Fig. 5 Effect of liquid volume on phenyllactic acid production

2.2.5 搖床轉速對苯乳酸產量的影響

搖床轉速對苯乳酸產量的影響見圖6。由圖6可知，隨著搖床轉速在100～200 r/min范圍內的增加，苯乳酸產量逐漸增加；當搖床轉速為200 r/min時，苯乳酸產量達到最高值，為2.18 g/L；繼續(xù)增加轉速，苯乳酸產量下降。因此，選擇轉速200 r/min為響應面試驗優(yōu)化的中心點。

圖6 搖床轉速對苯乳酸產量的影響Fig. 6 Effect of shaker speed on phenyllactic acid production

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗結果及回歸模型方差分析

結合單因素試驗結果，進一步優(yōu)化菌株BLPC002產苯乳酸發(fā)酵工藝。選取接種量（A）、搖床轉速（B）、裝液量（C）、發(fā)酵溫度（D）作為影響因子，以苯乳酸產量為（Y）為響應值，設計Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表2?；貧w模型方差分析見表3。

表2 產苯乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for optimization of fermentation process of phenyllactic acid production

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

用Design Expect 8.0.6軟件統(tǒng)計計算，對表2的試驗結果進行多元回歸擬合，得到各因素水平對苯乳酸產量的二次多項回歸模型方程：

由表3可知，上述建立的回歸模型極顯著（P=0.000 1＜0.05），失擬項不顯著（P=0.362 8＞0.05）。因此，該回歸模型高度顯著，各試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次拋物面關系。該模型的決定系數(shù)R2為90.93%，校正決定系數(shù)R2adj=84.88%，表明該模型的預測值和實測值擬合良好，可以很好地解釋響應值的變化情況。4個因素對苯乳酸產量影響程度為發(fā)酵溫度＞接種量＞裝液量＞搖床轉速。其中，一次項A、C、D，二次項A2、B2、D2達到極顯著水平（P＜0.01），交互項AD，二次項C2達到顯著水平（P＜0.05），其他項均不顯著。綜合數(shù)據結果表明，該模型可以較好地反映出菌株BLPC002產苯乳酸發(fā)酵工藝中發(fā)酵溫度、接種量、裝液量、搖床轉速之間的關系，所得回歸方程能較好地預測苯乳酸產量在不同條件下的變化規(guī)律。

2.3.2 響應面因子交互作用分析

響應面圖和等高線圖可以用來直觀地表示各變量之間的交互作用及響應值在極點時各自變量的最佳水平。三維響應面圖曲面坡度幅度代表響應值的變化幅度，坡度越陡，對響應值影響越大，等高線圖為橢圓形代表交互作用強。接種量和發(fā)酵溫度交互作用對苯乳酸產量影響的響應面和等高線見圖7。由圖7可知，發(fā)酵溫度（D）與接種量（A）響應面圖曲面坡度明顯，等高線為橢圓形，表明二者交互作用對苯乳酸產量影響顯著，這與表3的分析結果相符。

圖7 接種量和發(fā)酵溫度交互作用對苯乳酸產量影響的響應面和等高線Fig. 7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum and fermentation temperature on phenyllactic acid production

2.3.3 響應面模型驗證試驗

通過對回歸方程各自變量求極值，得到回歸模型預測的最佳編碼值為A=-0.589 9，B=0.011 8，C=0.908 1，D=-1.399，對應的實際值為接種量2.410 1%，搖床轉速200.236 r/min，裝液量168.162 mL/500 mL，溫度32.601 ℃。此時，苯乳酸產量預測值為2.566 g/L?？紤]到實際操作需要，確定最佳發(fā)酵工藝條件分別為接種量2.5%，轉速200r/min，裝液量170 mL/500 mL，發(fā)酵溫度33 ℃。在該條件下進行5次平行驗證試驗，苯乳酸產量實際平均值為2.566 g/L，與預測值接近，說明該模型能準確反映各因素的變化與苯乳酸產量之間的關系，該模型的設計可靠。采用5 L發(fā)酵罐以優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行驗證，苯乳酸產量最高達到2.66 g/L。

3 結論

通過測定植物乳桿菌BLPC002的生長曲線，確定其接種種齡為24 h，培養(yǎng)方式為兼性厭氧，即菌體培養(yǎng)階段（前24 h）采用好氧方式，苯乳酸生產階段（后24 h）采用厭氧方式；通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計確定菌株BLPC002產苯乳酸最佳發(fā)酵工藝條件分別為接種量2.5%、搖床轉速200 r/min、裝液量170 mL/500 mL、發(fā)酵溫度33 ℃。苯乳酸的產量為2.66 g/L，較優(yōu)化前提高了1.6倍。后續(xù)將對植物乳桿菌BLPC002發(fā)酵的pH控制策略和補料工藝進行進一步研究，為苯乳酸生產的中試研究提供參考和依據。