山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠防醉及護(hù)肝作用研究

田穎蕾，夏 婷，康超艷，趙宇軒，呂 潔，張祥龍，王怡明，閆裕峰，朗繁繁，鄭 宇，3，王 敏*

（1.天津科技大學(xué)省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400；3.食醋發(fā)酵科學(xué)與工程山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030400）

酒是中國(guó)飲食文化的重要組成部分，至今已有五千多年歷史。有研究表明，機(jī)體對(duì)酒精攝入沒(méi)有安全劑量[1-2]。但其他研究發(fā)現(xiàn)，適度飲酒能愉悅身心、促進(jìn)血液循環(huán)，但飲酒過(guò)度會(huì)造成機(jī)體損傷[3-4]。酒精濫用和酒精依賴是當(dāng)前面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，人體一次性攝入70～80 g的酒精會(huì)引起中毒，達(dá)到250～500 g的劑量還會(huì)導(dǎo)致死亡。中國(guó)的飲酒致死人數(shù)世界第一，每年因此致死的人數(shù)多達(dá)70萬(wàn)[5]。急性醉酒又稱急性酒精中毒（acute alcoholism，AAH），一次性過(guò)量飲酒會(huì)使血液中乙醇含量升高，隨后引起頭暈、惡心嘔吐、昏迷等癥狀，并伴隨著神經(jīng)、消化、呼吸、心腦血管等系統(tǒng)的損傷[6-7]。酒精主要通過(guò)肝臟分解代謝，而多次AAH會(huì)引起酒精性肝病的發(fā)生[8-9]。近年來(lái)AAH的發(fā)病率越來(lái)越高，且自2019年以來(lái)成為除心腦血管及腫瘤外的世界第三大公共衛(wèi)生問(wèn)題[10]。

目前，天然化合物在酒精性肝病的治療中有很大潛力，研究表明一些膳食中的天然成分，如黃酮類化合物、白藜蘆醇等具有體外抗氧化活性，可對(duì)肝臟起到保護(hù)作用[11-13]。老陳醋中含氨基酸、有機(jī)酸、多酚、黃酮、川芎嗪、類黑精等活性成分，具有調(diào)節(jié)血脂、血糖、保護(hù)肝臟以及抗腫瘤等功效[14-16]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)山西老陳醋可以抑制小鼠細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP2E1）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性和Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用[17-18]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于食醋的醉酒預(yù)防作用機(jī)制研究相對(duì)較少，有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)建立急性醉酒小鼠模型，40只美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Researcch，ICR）小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組及低、高劑量山西老陳醋組，并在灌胃4 h后，觀察醉酒后小鼠行為學(xué)和小鼠肝組織病理學(xué)，分別檢測(cè)血清中乙醇含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性和肝組織生化指標(biāo)（乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetalde hydedehydrogenase，ALDH）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（mal ondialdehyde，MDA）。探究山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠的防醉和護(hù)肝作用。以期提升傳統(tǒng)食醋的保健價(jià)值和推動(dòng)相關(guān)功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

實(shí)驗(yàn)小鼠（挑選40只體質(zhì)量在30～34 g的無(wú)特定病原體（specific pathogen，SPF）級(jí)雄性美國(guó)癌癥研究所（ICR）小鼠）：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。山西老陳醋（釀造食醋，生產(chǎn)許可證號(hào)：SC10314012101087）：山西紫林醋業(yè)股份有限公司；56%vol紅星二鍋頭（食品生產(chǎn)許可證編號(hào)：SC11511160310087）：北京紅星股份有限公司。

1.1.2 試劑

肝素鈉：北京索萊寶科技有限公司；血乙醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白定量測(cè)定試劑盒（bicinchonininc acid，BCA）法、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CP1502型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；1500型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo有限公司；UVmini-1240型微量紫外分光光度計(jì)：蘇州島津儀器有限公司；Centrifuge 5418 R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf有限公司；1X2-1LLJ100普通光學(xué)顯微鏡：日本Olympus有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量分層后隨機(jī)分組為空白對(duì)照組、模型組及低、高劑量醋組，每組10只?？瞻讓?duì)照組小鼠不做處理；模型組小鼠灌胃給予56%vol紅星二鍋頭13 mL/kg；低、高劑量食醋組小鼠在分別灌胃給予山西老陳醋1.25 mg/kg和2.5 mg/kg，30 min后，一次性灌胃給予56%vol紅星二鍋頭13 mL/kg。

1.3.2 急性醉酒小鼠的行為學(xué)觀察

各組小鼠灌胃白酒后，立刻開(kāi)始計(jì)時(shí)并進(jìn)行翻正反射實(shí)驗(yàn)判斷小鼠是否醉酒（觀察小鼠是否可以保持背部向下30 s，能則判定為醉酒，反之則沒(méi)醉），并記錄醉酒時(shí)間（末次灌胃時(shí)間-翻正反射消失時(shí)間）、醒酒時(shí)間（翻正反射消失時(shí)間-翻正反射恢復(fù)時(shí)間）。

1.3.3 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

各組小鼠末次灌胃4.0 h后，迅速剖取肝臟，冰生理鹽水沖洗、擦干后稱其質(zhì)量，拍照；多聚甲醛（4%）固定肝組織，經(jīng)石蠟包埋后制成切片（5 μm），使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，光鏡觀察肝臟的病變情況。參考肉眼觀察法和脂肪變性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量肝臟組織損傷程度、肝竇充血程度和肝臟細(xì)胞空泡化程度等指標(biāo)[19-20]。

1.3.4 血清和肝臟中指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠在末次灌胃0.5 h和4.0 h后處死小鼠，眼球取血后，獲得的血液加入抗凝劑肝素鈉后在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心15 min后取上清液，-80 ℃保存待檢。根據(jù)試劑盒操作步驟檢測(cè)0.5 h、4 h血清乙醇含量和4 h血清ALT、AST活性。取4 h后處死的小鼠肝臟，以1∶9比例混入生理鹽水進(jìn)行液氮研磨，在4 ℃，4 500 r/min的條件下離心10 min后取上清液。取上述10%肝勻漿，使用試劑盒檢測(cè)4.0 h的ADH、ALDH、BCA、MDA、SOD和CAT水平。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（X±S）的表示，使用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05為依據(jù)，判斷差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠醉酒和醒酒時(shí)間的影響

急性酒精中毒后，小鼠由原來(lái)行動(dòng)敏捷、對(duì)外界環(huán)境的改變反應(yīng)敏感變?yōu)榕佬胁环€(wěn)易摔倒，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，最終蜷縮癱倒。本研究將翻正反射消失時(shí)間即醉酒時(shí)間的長(zhǎng)短作為評(píng)價(jià)藥物預(yù)防醉酒功效的行為學(xué)指標(biāo)。山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠醉酒、醒酒時(shí)間的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，與模型組小鼠的醉酒相比，高劑量老陳醋組能顯著延長(zhǎng)小鼠醉酒時(shí)間（P＜0.05），將醉酒時(shí)間由（27.71±16.27）min延長(zhǎng)至（44.00±9.35）min；同時(shí)，高劑量老陳醋組能使醉酒小鼠快速?gòu)淖砭茽顟B(tài)中醒來(lái)，縮短醒酒時(shí)間（P＜0.01），將醒酒時(shí)間由原來(lái)的（200.29±73.43）min縮短至（121.25±12.71）min。攝入老陳醋后，小鼠由“快醉慢醒”轉(zhuǎn)變?yōu)椤奥砜煨选?。結(jié)果表明山西老陳醋對(duì)在小鼠體內(nèi)的積累的酒精有較好的代謝作用，可以通過(guò)延長(zhǎng)醉酒時(shí)間和縮短醒酒時(shí)間起到減弱酒精麻痹，加速醒酒的作用。

表1 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠醉酒、醒酒時(shí)間的影響Table 1 Effects of Shanxi aged vinegar on drunkenness and sobering time of acute drunkenness mice

2.2 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠酒精含量的影響

肝臟是機(jī)體酒精代謝的主要器官，攝入的酒精經(jīng)胃腸道吸收后分散到血液中，導(dǎo)致血液中的酒精含量上升，之后被輸送到肝臟中進(jìn)行代謝而清除[21]。檢測(cè)血清中的酒精濃度一方面可以反映乙醇脫氫酶的活性，另一方面可以反映肝損傷程度[22]。山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠血清中酒精含量的影響見(jiàn)表2。

表2 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠血清中酒精含量的影響Table 2 Effects of Shanxi aged vinegar on alcohol contents in serum of acute drunkenness mice

由表2可知，與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠血乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.5 h顯著升高（P＜0.05），隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在4.0 h時(shí)升高更為明顯（P＜0.01）。與模型組相比，0.5 h的各劑量老陳醋組小鼠的血酒精含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），此時(shí)老陳醋對(duì)血清中酒精含量影響較?。辉?.0 h時(shí)，高劑量老陳醋組血酒精含量極顯著降低（P＜0.01），因此，高劑量醋對(duì)小鼠血清中酒精含量影響較大。

2.3 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠ADH、ALDH的影響

ADH和ALDH是體內(nèi)參與酒精代謝的關(guān)鍵酶，在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及線粒體中廣泛存在。乙醇在ADH的作用下分解為乙醛，乙醛在ALDH的作用下分解為乙酸，最終代謝成H2O和CO2，機(jī)體通過(guò)這種方式降低血液中的酒精濃度[23]。因此ADH和ALDH活性的變化可以直接影響血液中乙醇含量[24]。山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠肝臟ADH、ALDH水平的影響見(jiàn)表3。

表3 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠肝臟ADH、ALDH水平的影響Table 3 Effects of Shanxi aged vinegar on ADH and ALDH level in liver of acute drunkenness mice

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的ADH含量顯著降低（P＜0.05），ALDH含量極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各劑量山西老陳醋均極顯著提高小鼠ADH活性（P＜0.01），低、高劑量老陳醋組的ADH活性分別由（1.65±0.13）μg/mL升至（4.93±0.74）μg/mL、（6.08±1.24）μg/mL；而高劑量老陳醋組的ALDH活性上升較顯著（P＜0.05），由模型組的（15.12±0.82）μg/mL升至（18.6±1.70）μg/mL，因此，高劑量老陳醋組可顯著緩解小鼠的肝損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山西老陳醋可以通過(guò)提高ADH和ALDH的活力加快酒精在機(jī)體的代謝，降低血液中的酒精含量，起到一定的解酒作用。

2.4 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

肝組織病理切片能較直觀地觀察肝細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，判斷肝臟的損傷程度。由圖1（a）可知，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)酒精處理后的小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的病理形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為肝臟表面粗糙、顏色略顯泛白等。與模型組相比，經(jīng)山西老陳醋處理后，上述變化有所緩解，且高劑量老陳醋組緩解效果更明顯。

圖1 急性醉酒小鼠肝臟組織形態(tài)觀察（a）與HE染色鏡檢圖（b）Fig. 1 Liver histomorphology observation (a) and HE staining microscopic examination (b) of acute drunkenness mice

由圖1（b）可知，空白對(duì)照組小鼠的肝臟經(jīng)過(guò)HE染色后肝細(xì)胞狀態(tài)健康，整體無(wú)變性、壞死、充血等病變現(xiàn)象。模型組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大面積空泡變性和充血。攝入老陳醋后肝細(xì)胞損傷程度得到減輕，以少量空泡變性為主，病變狀態(tài)得到緩解，以高劑量老陳醋組緩解更為明顯。

2.5 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠肝功酶的影響

ALT和AST是肝中的兩種主要的轉(zhuǎn)氨酶，肝細(xì)胞受損后這兩種酶的活性提高，所以血清中ALT、AST的含量反應(yīng)了肝臟的健康狀況[25-26]。山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平的影響見(jiàn)表4。

表4 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平的影響Table 4 Effects of Shanxi aged vinegar on ALT and AST level in serum of acute drunkenness mice

由表4可知，模型組血清中ALT、AST水平較空白對(duì)照組顯著增高，其含量分別增高至（19.93±2.58）U/g和（24.52±2.80）U/g（P＜0.05）。與模型組相比，低劑量老陳醋的攝入顯著降低了小鼠血清中ALT、AST水平（P＜0.05），其中高劑量老陳醋的攝入使模型組高水平的ALT、AST分別降低至（12.83±3.62）U/g和（14.22±1.56）U/g（P＜0.01）。結(jié)果表明山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠的肝損傷有一定的保護(hù)作用。因此，高劑量的山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平影響顯著。

2.6 山西老陳醋對(duì)急性醉酒小鼠肝臟CAT、SOD和MDA水平的影響

研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致急性酒精肝損傷的發(fā)病機(jī)制之一[27]。MDA由脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生，MDA水平的提高可干擾抗氧化預(yù)防，引起肝臟損傷[28]。另一方面，SOD和CAT主要在機(jī)體中起抗氧化作用。SOD和CAT分別在活性氧（reactive oxygen species，ROS）和過(guò)氧化氫的催化中起作用，清除體內(nèi)多余的自由基，將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱跖懦鲶w外[29-30]。這些抗氧化劑均能保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激的損害。山西老陳醋對(duì)醉酒小鼠肝臟MDA、CAT和SOD水平影響見(jiàn)表5。

表5 山西老陳醋對(duì)醉酒小鼠肝臟MDA、CAT和SOD水平影響Table 5 Effects of Shanxi aged vinegar on MDA, CAT and SOD level in liver of drunkenness mice

由表5可知，模型組MDA含量相較于空白對(duì)照組顯著升高至（2.89±0.39）nmol/mg（P＜0.05），與模型組相比，各劑量老陳醋組的MDA含量則有所下降，其中高劑量老陳醋組下降最明顯（P＜0.05），MDA含量由（2.89±0.39）nmol/mg下降至（2.15± 0.18）nmol/mg。模型組CAT和SOD活性較空白對(duì)照組顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，高劑量老陳醋組的CAT、SOD活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。CAT含量由（7.25±0.09）U/mg上升至（7.59±0.13）U/mg（P＜0.05）；SOD含量由（353.42±28.35）U/mg上升至（425.92±30.29）U/mg（P＜0.05）。結(jié)果表明山西老陳醋可通過(guò)減弱急性醉酒小鼠體內(nèi)的氧化水平，增強(qiáng)抗氧化能力，改善由急性醉酒引起的肝損傷。

3 結(jié)論

山西老陳醋是一種健康發(fā)酵食品。攝入食醋能夠有效改善因急性醉酒引起的醉酒癥狀，并且能夠降低醉酒小鼠的肝功酶活性和氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮良好的護(hù)肝作用。與模型組相比，高劑量醋組可顯著延長(zhǎng)醉酒時(shí)間至（44.00±9.35）min（P＜0.05）、醒酒時(shí)間極顯著縮短至（121.25±12.71）min（P＜0.01）；血清中乙醇含量及ALT、AST活性顯著降低為（37.01±4.24）mg/100 mL、（12.83±3.62）U/g、（14.22±1.56）U/g；肝組織中乙醇脫氫酶（ADH）活性極顯著增加（P＜0.01）、乙醛脫氫酶（ALDH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著增加（P＜0.05），且丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.05）。食醋組肝臟病變程度減輕，切片顯示空泡面積減少。本研究揭示了山西老陳醋能緩解急性醉酒導(dǎo)致的AAH和肝損傷。但對(duì)于具有解酒護(hù)肝功能的保健山西老陳醋產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)仍需要進(jìn)一步的研究。