貝萊斯芽孢桿菌抑尖孢鐮刀菌脂肽類物質(zhì)的鑒定

郭 蔓，張朝正，趙 華*

（天津科技大學生物工程學院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室天津市工業(yè)微生物重點實驗室天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播的、能引起多種植株萎蔫枯死的一種土傳性病害病原菌[1]，對番茄（Lycopersicon esculentum）、葫蘆科（Cucurbitaceae）植物、棉花（Gossypiumspp.）和香蕉（Musa nana）等高經(jīng)濟價值作物具有很大的危害[2]。尖孢鐮刀菌在防控方面非常的困難，主要是因為尖孢鐮刀菌除了能夠在宿主植物中存活外，還能在土壤及空氣中存活10年以上，仍表現(xiàn)出很強的致病性[3]。該病原菌最先由LINK發(fā)現(xiàn)并命名[4]，其形態(tài)差異較大，迄今為止已有多種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）被分離并鑒定，根據(jù)侵染的農(nóng)作物的不同，將尖孢鐮刀菌分為不同的?；?，而又根據(jù)其致病能力的差異在不同專化型下可分為不同的生理小種[5]。

植物病毒害有多種防治方法[6]，其中，生物防治是一種環(huán)保無污染的方式。生物防治是利用微生物之間，以及微生物與植物之間的相互作用實現(xiàn)有益微生物對有害微生物的抑制作用[7]。許多微生物通過產(chǎn)生拮抗物質(zhì)抑制尖孢鐮刀菌的生長，是一種經(jīng)濟有效的方法，不僅不會對環(huán)境造成二次污染，還能夠從源頭控制其生長[8]。對于尖孢鐮刀菌引起的枯萎病進行生物防治的微生物有真菌、細菌、放線菌[9-10]。芽孢桿菌屬（Bacillussp.）是一類重要的生防細菌，其多個種類具有較好的生物防治功能[11]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）廣泛存在于自然界中，因其具有拮抗范圍廣、效果明顯，繁殖快，無害無污染等優(yōu)點而被廣泛應用為生防細菌[12]。研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對多種真菌性病原體都具有很好拮抗效果，其分泌的纖維素酶和蛋白酶等拮抗物質(zhì)抑制病原菌的生長，由于抑菌物質(zhì)分泌在胞外，拮抗效果更加明顯[13]。

芽孢桿菌在生長與繁殖過程中會產(chǎn)生許多具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物[14]，如細菌素[15]、伊枯草菌素、表面活性素、二磷酸硫胺素、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶[16]、堿性蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等[17]。有研究表明，從土壤中分離出來的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對番茄灰斑病菌具有抑制作用，抑菌圈直徑可達15.5 mm，其無菌發(fā)酵液對灰斑病菌絲的生長有強烈的抑制作用[18]；貝萊斯芽孢桿菌B18對香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；蜔釒?號生理小種的生物防治有較好的效果，防治效果高達67.9%[19]。前期已從實驗室分離篩選獲得1株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9，其代謝產(chǎn)物對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）生長具有較強的抑制作用[20-21]。前期的實驗已經(jīng)確定產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為脂肽類抗生素。因此，本研究對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)進行分離純化和鑒定，將其與已報道的抑菌活性代謝產(chǎn)物進行比較，以期獲得新物質(zhì)，為利用生防制劑控制尖孢鐮刀菌提供理論依據(jù)，為微生物生防農(nóng)藥的化學合成提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9：天津科技大學工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室篩選獲得；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大學菌種保藏中心，編號TCCC40009。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[22]：酵母浸物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH7.2～7.4，固體培養(yǎng)基時另添加瓊脂18.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[23]：馬鈴薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。固體培養(yǎng)基時另添加瓊脂18 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：天津一方科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：上海易勢化工有限公司；氯化鈉、甲醇（分析純）：天津艾利安電子科技有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：天津市北方醫(yī)化學試劑廠；乙腈（色譜級）：天津康科德科技有限公司；甲酸（色譜級）：天津益仁達化工有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1815高速離心機：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162 MBE電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SY.45-NJB牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；G6545B高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）儀、1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肽類抗菌物質(zhì)的提取

酸沉淀法提?。簩? mL貝萊斯芽孢桿菌P9接種于100 mL LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)48 h，收集50 mL發(fā)酵液至離心管中，8 000 r/min離心20 min。取上清液，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，4 ℃靜置12 h。收集溶液，8 000 r/min離心20 min，棄上清液。所得沉淀加入5 mL甲醇，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，室溫抽提8 h，抽提過程中可以放在超聲儀中加速溶解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，抽提過程重復3次，收集所有抽提液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。濃縮液用0.22 μm的濾膜進行抽濾，即得到抗菌脂肽粗提物。

有機溶劑沉淀法提?。喝?0 mL無水乙醇緩慢添加到50 mL發(fā)酵液中，邊加邊攪拌，然后在4 ℃條件下靜置過夜，4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，分別收集上清液和沉淀。將上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，經(jīng)0.22 μm的生物濾膜過濾除菌體，即得到抗菌脂肽粗提物。

1.3.2 體外抑菌活性的測定

尖孢鐮刀菌孢子液制備：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）劃線接種于PDA培養(yǎng)基，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d，使用滅菌打孔器在菌落邊緣區(qū)域取直徑為5 mm的菌餅，放置于PDA平板中央，30 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，取無菌生理鹽水水洗，所得的水洗液經(jīng)滅菌的4層無菌濾布過濾即得真菌孢子液，將所得的真菌孢子液稀釋至OD600nm值為0.9，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌活性的測定：取100μL尖孢鐮刀菌孢子液均勻涂布于PDA平板上，在距平板中心25 mm處放置牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm），每個牛津杯中加入利用不同提取方法提取的抗菌脂肽提取液100 μL，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，采用牛津杯法測量抑菌圈直徑[24]。

1.3.3 脂肽類物質(zhì)的高效液相色譜分析

將提取的脂肽類物質(zhì)粗提物進行高效液相色譜分析，色譜條件：Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），進樣量20 μL，流動相為乙腈∶水=40∶60（V/V），流速1 mL/min，檢測波長210 nm，分析時間14 min。通過色譜圖分析該脂肽類物質(zhì)粗提物的種類。

1.3.4 脂肽類抗生素的分離制備

制備柱為EclipseXDB-C18色譜柱（5μm，9.4mm×250mm），進樣量1 mL，流動相為乙腈∶水=40∶60（V/V），流速5 mL/min，檢測波長210 nm，按峰閾值收集樣品。將收集到的各峰樣品在65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，進行冷凍干燥，可得到固體脂肽類物質(zhì)[25]。采用牛津杯法測定體外抑菌活性，將有抑菌活性的物質(zhì)進行質(zhì)譜分析。

1.3.5 脂肽類物質(zhì)高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析

將1.3.4中多功能液相分離制備出來的有抑菌活性的組分進行高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析。液相色譜條件為：ZOBAX C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），進樣量5 μL，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，流速0.5 mL/min，檢測時間15 min。流動相A：0.1%甲酸的水，流動相B：100%乙腈，A∶B=60∶40（V/V）。質(zhì)譜條件：毛細管電壓160 V，噴霧電壓1 kV，干燥氣溫度320 ℃，正離子模式檢測，檢測范圍為150～1 000 amu。利用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）-質(zhì)譜測定脂肽類化合物的相對分子質(zhì)量，并對一級質(zhì)譜的主要離子峰進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽類抗生素粗提物體外抑菌活性的測定

脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌的抑制作用見圖1。由圖1可知，通過酸沉淀法和有機溶劑沉淀法從貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液中提取出來的脂肽類抗生素粗提物對于尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）都有明顯的體外抑菌活性，抑菌圈直徑分別為（13.5±0.05）mm，（8.5±0.08）mm，其中，酸沉淀法的抑菌效果優(yōu)于有機溶劑沉淀法。因此，對酸沉淀法提取出來的脂肽類抗生素粗提物進行進一步研究。

圖1 脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of crude extract of lipopeptide antibiotics on Fusarium oxysporum

2.2 脂肽類抗生素粗提物的高效液相色譜分析

采用高效液相色譜分析酸沉淀法得到的脂肽類抗生素粗提物，結(jié)果見圖2。由圖2可知，該脂肽類抗生素粗提物分別在3.1 min、6.6 min、7.1 min、7.6 min、8.1 min、9.2 min、11.1 min出現(xiàn)7個主要的離子峰，推測該脂肽類抗生素粗提物主要有7種組分，編號為1#～7#。

圖2 脂肽類抗生素粗提物的高效液相色譜分析結(jié)果Fig. 2 Analysis results of crude extract of lipopeptide antibiotics by HPLC

2.3 脂肽類抗生素物質(zhì)的分離制備

通過多功能制備液相儀對這7種組分進行分離，并利用牛津杯法測定各組分的抑菌性能，結(jié)果見表1。由表1可知，7種組分中有4種組分有明顯的抑制尖孢鐮刀菌生長的作用，分別為組分2#、4#、6#、7#，其對尖孢鐮刀菌的抑菌圈直徑分別為（13.3±0.01）mm、（13.5±0.04）mm、（14.5±0.02）mm、（13.2±0.01）mm。

表1 7種組分對尖孢鐮刀菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 7 components on Fusarium oxysporum

2.4 脂肽類抗生素物質(zhì)的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析

采用高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀對4種組分（2#、4#、6#、7#）的一級質(zhì)譜的主要離子峰進行分析，結(jié)果見圖3～圖6。

圖3 組分2#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 3 Analysis results of component 2#by HPLC-Q-TOF-MS

圖4 組分4#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of component 4#by HPLC-Q-TOF-MS

圖5 組分6#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 5 Analysis results of component 6#by HPLC-Q-TOF-MS

圖6 組分7#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 6 Analysis results of component 7#by HPLC-Q-TOF-MS

由圖3可知，組分2#的質(zhì)譜圖中，在質(zhì)核比1 036.691 9、1 058.672 9、1 074.567 9處有準碎片離子峰，與研究報道中[26]的芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽化合物的精確質(zhì)荷比值[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+的數(shù)據(jù)吻合，可以得出組分2#中可能含有C15SurfactinA或C16SurfactinB或C15Surfactin C。這三種物質(zhì)的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+完全相同，為同分異構(gòu)體。SurfactinA、SurfactinB、SurfactinC的結(jié)構(gòu)式如下：

由圖4可知，組分4#的質(zhì)譜圖中，在質(zhì)核比1 045.557 8、1 067.539 1、1 083.507 3處有準碎片離子峰，與魯小城[26]研究中C15BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質(zhì)荷比相符合，所以確定組分4#為C15BacillomycinD。BacillomycinD的結(jié)構(gòu)式如下：

由圖5可知，組分6#的質(zhì)譜圖中，在質(zhì)核比1 031.542 1、1 053.522 9、1 069.492 5處有準碎片離子峰，與文獻[26]中C14BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質(zhì)荷比相符合，從而確定組分6#為C14BacillomycinD。

由圖6可知，組分7#的質(zhì)譜圖中，在質(zhì)核比1 059.572 9、10 81.553 4、1 097.545 1處有準碎片離子峰，與文獻[26]中C16BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質(zhì)荷比相符合，確定組分7#為C16BacillomycinD。

3 結(jié)論

本研究選用貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對象，通過酸沉淀法和有機溶劑沉淀法從其發(fā)酵液中提取脂肽類抗生素粗提物。通過牛津杯抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，該脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）有較好的抑菌活性，且酸沉淀法提取的粗提物抑菌活性較高。通過多功能制備液相儀從粗提物中共分離出7種成分，其中4種成分有抑菌活性。通過高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀分析對這4種成分進行鑒定，確定菌株P(guān)9發(fā)酵液中具有抗菌活性的脂肽類物質(zhì)為C14-16BacillomycinD的同系物及C15SurfactinA或C15Surfactin C或C16SurfactinB。本研究闡明了貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）生長的主要活性成分，為利用生防制劑控制尖孢鐮刀菌生長提供理論依據(jù)。