外源添加單一氨基酸對桑葚酒風(fēng)味品質(zhì)的影響

張雙梅，鄭瑩媛，張秀艷*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

桑葚（Fructus mori）屬于藥食同源漿果，因不耐貯藏而常被加工成果酒等產(chǎn)品。桑葚酒不僅營養(yǎng)豐富且具健康功效，因此受到消費(fèi)者青睞[1]。然而，桑葚酒存在風(fēng)味單一的問題[2]，這必將影響桑葚酒在果酒市場的競爭力。果酒風(fēng)味化合物的種類和含量是影響果酒風(fēng)味復(fù)雜性的重要因素，它受發(fā)酵微生物、發(fā)酵工藝和果汁化學(xué)組成等的影響，因此可通過優(yōu)選酵母菌株、優(yōu)化發(fā)酵工藝、優(yōu)化果汁組成等解決果酒風(fēng)味單一問題[3-5]。

酵母種類及發(fā)酵工藝是影響果酒風(fēng)味的重要因素。研究表明，利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces）混合發(fā)酵可有效改善葡萄酒、櫻桃酒、榴蓮酒和甘蔗酒等果酒的風(fēng)味和品質(zhì)[6-9]。優(yōu)化酵母接種量及其發(fā)酵條件等也可改善果酒風(fēng)味品質(zhì)[10-11]。氨基酸的種類及濃度對果酒香氣的復(fù)雜性具有重要影響[12]。漿果中的氨基酸是酵母可同化氮的主要來源之一，可被酵母吸收并用于生長和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，如產(chǎn)生高級醇及酯類物質(zhì)[13]。不同氨基酸經(jīng)微生物代謝后可產(chǎn)生不同風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)而影響果酒的風(fēng)味和品質(zhì)，如支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）與苯丙氨酸可顯著提高葡萄酒中相應(yīng)高級醇及其乙酸酯的含量[14]。GUTIéRREZ A等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在酵母生長穩(wěn)定期添加精氨酸，可促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成。增加果汁中蘇氨酸含量，則可增加果酒中異戊醇、苯乙醇、乙酸、丙酸的含量，并降低異丁醇的含量[16]。

項(xiàng)目組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24與釀酒酵母混合發(fā)酵可以顯著改善桑葚酒的風(fēng)味品質(zhì)。同時(shí)，相對于葡萄汁的氨基酸含量，大十桑葚汁所含氨基酸較少，尤其是對香氣影響較大的纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的含量[17]。由此推斷，桑葚汁中氨基酸濃度低可能是造成桑葚酒風(fēng)味單一的原因。鑒于此，本研究在桑葚汁中分別添加纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及苯丙氨酸，并采用P.kudriavzeviiF2-24與釀酒酵母混合發(fā)酵桑葚酒，以不添加氨基酸的混合發(fā)酵桑葚酒為對照，通過對桑葚酒的理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及感官品質(zhì)進(jìn)行分析，探究外源添加單一氨基酸對桑葚酒風(fēng)味品質(zhì)的影響，以期為高品質(zhì)桑葚酒開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大十桑葚：來自湖北省武漢市黃陂區(qū)，含糖量115.24g/L，含酸量16.75 g/L（以酒石酸計(jì)）。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC：法國LAFFORT公司；庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸：合肥蘭杰科技有限公司；H2SO3、NaCl、環(huán)己酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)：蘇中凈化設(shè)備有限公司；TQ8040型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；固相微萃取針頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑葚酒的發(fā)酵流程及操作要點(diǎn)

桑葚除梗破碎→巴氏殺菌→浸漬→發(fā)酵→過濾→裝瓶→陳釀→桑葚酒

操作要點(diǎn)：桑葚除梗破碎后得到桑葚醪，將其裝入15個(gè)250 mL發(fā)酵瓶中（裝液量為80%）。向發(fā)酵瓶中分別單獨(dú)添加400 mg/L的異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸（發(fā)酵酒分別命名為Ile-w，Leu-w，Phe-w，Val-w），以不添加氨基酸的發(fā)酵酒作為對照（Control）。將裝有醪液的發(fā)酵瓶置于水浴鍋中加熱至80 ℃保持45 min，取出冷卻后加入60 mg/L SO2，混勻置于4 ℃冰箱過夜。按照1×106CFU/mL的接種量，同時(shí)在桑葚醪中接入活化的庫德里阿茲威氏畢赤酵母F2-24和釀酒酵母SC（1∶1）進(jìn)行混合發(fā)酵（20 ℃），直至殘?zhí)牵? g/L（以還原糖計(jì)）即進(jìn)行壓榨過濾，在上清液中加入50 mg/L SO2后裝入無菌瓶中在4 ℃貯藏。每種酒樣做3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 理化指標(biāo)分析

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法測定[18]；酒精度采用快速氧化法測定[19]；總酸和揮發(fā)酸的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

樣品處理：取8 mL酒樣移入20 mL頂空瓶中，加入2.00 g NaCl，加入10 μL環(huán)己酮（0.4 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)物，在40 ℃條件下于恒溫磁力攪拌器中平衡15 min，萃取30 min，后插入GC進(jìn)樣口解吸5 min。

色譜條件：DB-5石英毛細(xì)管柱（30m×320 μm，0.25 μm），程序升溫：起始溫度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至130 ℃，然后以4 ℃/min升至250 ℃保持5 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，燈絲發(fā)熱電流0.25 mA，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～350 amu。

定性定量分析：通過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)的Wiley、Nistdemo質(zhì)譜庫定性，各香氣物質(zhì)組分的質(zhì)譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫檢索，結(jié)合解析譜圖，確定香氣物質(zhì)。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 感官分析

感官分析參照BELDA I等[20]的方法，評議小組由10名成員（6名女性和4名男性）組成，年齡為25～46歲。在室溫且通風(fēng)良好條件下對酒樣的外觀、香氣和口感進(jìn)行評價(jià)。評分等級中的分?jǐn)?shù)表示特性的有無和強(qiáng)弱。其中，“0”表示無此特征，“1～2”表示非常弱，“3～4”表示弱，“5～6”表示中等，“7～8”表示強(qiáng)，“9”表示非常強(qiáng)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖由Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6.0執(zhí)行。單因素方差分析通過SPSS 19.0完成。利用Multi Experiment Viewer 4.9.0對所有風(fēng)味物質(zhì)和酒樣進(jìn)行聚類分析和熱圖可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酒理化指標(biāo)分析

桑葚酒理化指標(biāo)分析見表1。由表1可知，外源添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸對桑葚酒的酒精度、總酸和揮發(fā)酸無顯著影響（P＞0.05），顯著降低其殘?zhí)呛浚≒＜0.05）。說明外源添加氨基酸對桑葚酒的理化指標(biāo)無明顯影響，這與ZHONG X F等[21]的研究結(jié)果一致。

表1 添加單一氨基酸的桑葚酒的理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical indexes of mulberry wine with single amino acid addition

2.2 桑葚酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味成分及含量測定結(jié)果見表2。由表2可知，不同氨基酸添加的桑葚酒中共檢測到40種風(fēng)味化合物，包括7種品種香氣化合物和33種發(fā)酵香氣化合物。與未添加氨基酸的混合發(fā)酵葡萄酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量相比（36.07 mg/L），添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及纈氨酸均顯著提高了桑葚酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量（42.38～84.58 mg/L）（P＜0.05）。

表2 添加單一氨基酸的桑葚酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 2 Contents of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition mg/L

續(xù)表

2.2.1 品種香氣化合物分析

由表2可知，酒樣中共檢測到7種品種香氣化合物，包括1種C6化合物，5種萜烯類和1種C13-降異戊二烯類化合物，其中風(fēng)味活性化合物（OAV＞1）有芳樟醇、香茅醇、香葉醇、香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮。與Control相比，Ile-w中芳樟醇和香茅醇含量顯著增加（P＜0.05），1-己醇含量顯著減少（P＜0.05）；Leu-w中芳樟醇和香茅醇含量顯著增加（P＜0.05）；Phe-w中β-紫羅蘭酮含量顯著增加（P＜0.05）；而Val-w中風(fēng)味活性化合物含量降低（P＜0.05），1-己醇含量顯著增加（P＜0.05）。另外，除Phe-w中品種香氣化合物含量顯著降低（減少了0.08 mg/L）外，Ile-w、Leu-w和Val-w中品種香氣化合物的含量無明顯變化。這說明，外源添加氨基酸僅會(huì)影響部分品種香氣化合物的含量，對品種香氣的總含量影響較小。

2.2.2 發(fā)酵香氣化合物分析

由表2可知，33種發(fā)酵香氣化合物中包括了9種高級醇類，6種乙酸酯類、8種脂肪酸乙酯類、1種其他酯類、6種脂肪酸類和3種醛酮類化合物，其中風(fēng)味活性化合物（OAV＞1）有1-壬醇、正庚醇、辛烯醇、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、壬醛、癸醛和苯乙醛。與對照相比，Ile-w、Leu-w、Phe-w和Val-w中發(fā)酵香氣化合物，尤其是高級醇類和乙酸酯類化合物的含量顯著提高（P＜0.05）。Ile-w中活性戊醇和乙酸活性戊酯的含量顯著提高（P＜0.05），分別為40.67 mg/L和4.82 mg/L，但其異戊醇含量顯著降低（P＜0.05）。Leu-w中異戊醇和乙酸異戊酯含量顯著增加（P＜0.05），分別為45.20 mg/L和10.42 mg/L，但活性戊醇含量顯著降低（P＜0.05）。Phe-w中苯乙醇和乙酸苯乙酯含量顯著增加，分別為47.46 mg/L和4.79 mg/L，且苯乙醇含量是對照的9.89倍。Val-w中異丁醇和乙酸異丁酯含量顯著提高（P＜0.05），其異丁醇為9.70 mg/L，乙酸異丁酯含量為對照的5.50倍。這主要是因?yàn)樘砑拥牧涟彼?、異亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸分別為異戊醇、活性戊醇、苯乙醇和異丁醇的前體物，因此在桑葚酒中單一添加不同種類氨基酸可增加相應(yīng)高級醇的含量，從而提高其相應(yīng)的酯類物質(zhì)含量，這與LYUMUGABE F等[31-32]所報(bào)道的一致。

此外，添加不同種類氨基酸不僅可提高桑葚酒中對應(yīng)高級醇及其酯的含量，還可對異丁醇、1-壬醇、正庚醇、乙酸丙酯和辛酸乙酯等化合物的含量產(chǎn)生顯著影響。如除Val-w外，添加其他種類氨基酸的桑葚酒中異丁醇含量均增加，Phe-w和Val-w中1-壬醇含量顯著增加（P＜0.05），Ile-w和Leu-w中正庚醇含量顯著降低（P＜0.05），而Val-w中乙酸丙酯含量顯著增加（P＜0.05）。同時(shí)，添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸均可提高辛酸乙酯的含量。

2.3 桑葚酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析

桑葚酒的40種揮發(fā)性風(fēng)味化合物的聚類分析結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，5種桑葚酒被分為2類，Ile-w和Leu-w聚為一類，Control、Phe-w和Val-w聚為一類。40種風(fēng)味物質(zhì)被分為5類，分別命名為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類、Ⅳ類和V類風(fēng)味化合物。Control富含部分Ⅱ類風(fēng)味化合物（苯乙醛、壬醛、正庚醇和辛酸）和部分Ⅳ類風(fēng)味化合物（己酸、1-己醇和1-辛醇）。Ile-w富含全部Ⅰ類風(fēng)味化合物（香茅醇、乙酸丁酯、乙酸活性戊酯、活性戊醇和2-甲基丁酸）和部分V類風(fēng)味化合物（芳樟醇、松油醇和9-癸烯酸乙酯）。Leu-w富含全部V類風(fēng)味化合物，包括芳樟醇、松油醇、香葉基丙酮、壬酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等萜烯類化合物和酯類化合物。Val-w富含全部Ⅳ類風(fēng)味化合物（異丁醇、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、異丁酸等）、部分Ⅱ類風(fēng)味化合物（壬醛、正庚醇、1-壬醇、辛酸和癸酸）和部分V類風(fēng)味化合物（松油醇、壬酸乙酯和庚酸乙酯等）。Phe-w富含全部Ⅱ類和Ⅲ類風(fēng)味化合物，包括癸醛、苯乙醛、苯乙醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯和月桂酸乙酯等化合物。由此可知，單一添加氨基酸除了影響與其代謝直接相關(guān)的高級醇及酯類物質(zhì)的含量外，也會(huì)影響其他香氣化合物的代謝?？傊?，與對照相比，單一添加氨基酸增加了桑葚酒萜烯類、高級醇類及酯類物質(zhì)的種類與含量。

圖1 添加單一氨基酸的桑葚酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition

2.4 桑葚酒的感官評定結(jié)果

添加單一氨基酸的桑葚酒感官評定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，所有桑葚酒的外觀無顯著差異（P＞0.05），平均分?jǐn)?shù)均在5.0～5.5分，外觀均為紫紅色、澄清且有光澤。氨基酸的添加降低了桑葚酒中不良的草本味，這可能與酒樣中C6化合物等具有生青味物質(zhì)減少有關(guān)。添加不同種類的氨基酸對桑葚酒的感官品質(zhì)有不同的影響。Phe-w的花香評分較高，但其果香評分低于Control。與Control相比，Ile-w、Leu-w和Val-w果香評分較高，而花香并無顯著改變（P＞0.05）。此外，與Control相比，添加不同氨基酸的桑葚酒的口感評分均顯著提高（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，添加單一氨基酸可以改良桑葚酒的感官品質(zhì)，但可能會(huì)使桑葚酒某一香氣較為突出。這與HERNáNDEZ-ORTE P等[33]在使用釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵葡萄酒中添加單一氨基酸所得結(jié)果一致。

圖2 添加單一氨基酸的桑葚酒的感官評定結(jié)果Fig. 2 Sensory evaluation results of mulberry wine with single amino acid addition

3 結(jié)論

在桑葚汁中添加Ile、Leu、Phe和Val不影響桑葚酒的理化指標(biāo)，但能顯著增加桑葚酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量（P＜0.05），尤其是發(fā)酵香氣化合物。不同氨基酸添加可顯著影響桑葚酒中不同類型風(fēng)味化合物的含量，如添加異亮氨酸顯著增加了桑葚酒中活性戊醇、乙酸活性戊酯及辛酸乙酯的含量；添加亮氨酸顯著增加了桑葚酒中異戊醇、乙酸異戊酯及辛酸乙酯的含量；添加苯丙氨酸顯著增加了桑葚酒中β-紫羅蘭酮、苯乙醇及乙酸苯乙酯的含量，降低了1-己醇的含量；添加纈氨酸顯著增加了桑葚酒中異丁醇和乙酸異丁酯的含量（P＜0.05）。此外，外源添加氨基酸可顯著改善桑葚酒的感官品質(zhì)，但過多添加單一氨基酸可能會(huì)導(dǎo)致桑葚酒風(fēng)味失去平衡。研究結(jié)果將為桑葚酒風(fēng)味品質(zhì)的改良提供新思路，為其他果酒風(fēng)味品質(zhì)改良提供借鑒。