醋酸桿菌代謝特性與解酒護肝作用機制研究進(jìn)展

尹明雨，陳 敏，趙一夢*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院，上海 200438）

醋酸桿菌（Acetobacter aceti，AA）廣泛分布于自然界的含糖或酸性物質(zhì)中，具有快速適應(yīng)不同生境的典型生物[1-2]。AA是革蘭氏陰性或不定、專性需氧菌，形狀為橢圓形或桿狀，可以單個、成對或成鏈出現(xiàn)，長0.8～4.5 μm、寬0.4～1.0 μm。醋酸桿菌生長的最適酸堿度pH值為5.0～6.5[3-4]。醋酸菌科按其發(fā)育最適溫度和特性分為兩個主要的屬——醋桿菌屬（發(fā)育適溫在30 ℃以上，氧化酒精為乙酸）和葡糖桿菌屬（發(fā)育適溫在30 ℃以下，氧化葡萄糖為葡萄糖酸）[5]，通過現(xiàn)代脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）-核糖體核糖核酸（ribosome ribonucleic acid，rRNA）雜交、DNA-DNA雜交和核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）基因序列（5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA）技術(shù)對醋酸桿菌進(jìn)行基因分型鑒定，截至目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)55個菌屬屬于醋酸菌科[6]。在這些菌屬中應(yīng)用較廣、研究較成熟的是醋酸桿菌屬、葡糖醋酸桿菌屬和葡糖酸醋酸桿菌屬[6]。

1 醋酸桿菌的有氧呼吸

與許多需氧菌相似，醋酸菌通過有氧呼吸作用來獲得維持生理作用的大部分能量[19]。在有氧呼吸中，前體物丙酮酸在檸檬酸循環(huán)中被完全氧化成二氧化碳。隨后，在檸檬酸循環(huán)中形成的還原電子受體穿梭到細(xì)胞質(zhì)膜中[20]。質(zhì)膜中進(jìn)行的呼吸鏈氧化還原的電子載體與電子受體在氧化磷酸化作用下形成水分子，同時將質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)中排除，產(chǎn)生質(zhì)子梯度?？缒と姿嵯佘彰负厦福╰ransmembrane adenosine triphosphatase synthase，F(xiàn)1F0-ATPase）將質(zhì)子轉(zhuǎn)移回細(xì)胞來平衡這種質(zhì)子動力，實現(xiàn)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的生物合成[21]（見圖1）。

醋酸桿菌呼吸系統(tǒng)的基本成分由兩種周質(zhì)脫氫酶組成，轉(zhuǎn)氫酶/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）-泛醌氧化還原酶-依賴性脫氫酶和泛醇氧化酶型的兩種末端氧化酶[17]。在氧化過程中，泛醇以其還原形式泛醌（ubiquinone，UQ）穿梭于呼吸蛋白。轉(zhuǎn)氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）：泛醌氧化還原酶的反應(yīng)實現(xiàn)了NADP+和NAD+的再生以及H+的排除。末端氧化酶接受來自泛醌的電子[22]，將其轉(zhuǎn)移到電子受體O2形成H2O。

醋酸菌有兩個末端泛醇氧化酶，命名為細(xì)胞色素bo3泛醇氧化酶和細(xì)胞色素bd喹啉氧化酶[23]。細(xì)胞色素bo3泛醇氧化酶催化電子的接受進(jìn)而產(chǎn)生質(zhì)子動力，而細(xì)胞色素bd喹啉氧化酶將泛醇再氧化為泛醌，從而快速再生泛醌，有助于呼吸鏈或氧化發(fā)酵進(jìn)一步反應(yīng)[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在氧化葡糖桿菌中，細(xì)胞色素bd喹啉氧化酶在低酸堿度下特別活躍[24-25]，這表明細(xì)胞色素bo3泛醇氧化酶可能在早期生長階段作為主要的末端氧化酶，當(dāng)培養(yǎng)物的酸堿度接近中性，在氧化發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物而導(dǎo)致酸堿度降低時，細(xì)胞色素bd喹啉氧化酶變得活躍以維持氧化發(fā)酵的進(jìn)行[26]。

表1 醋酸桿菌的菌屬及種的數(shù)量概況Table 1 Overview of the number of genus and species of Acetobacter aceti

2 醋酸桿菌的有氧代謝

有氧代謝是底物不完全氧化、使反應(yīng)液中累積了不完全氧化生成物的發(fā)酵形式[27]。氧化發(fā)酵是一種“溢出代謝”，與通過有氧呼吸將底物完全氧化成二氧化碳和水相比，氧化發(fā)酵節(jié)省了能量[3，6，28]。醋酸桿菌是能進(jìn)行氧化發(fā)酵的突出菌，通常醋酸桿菌將乙醇、碳水化合物和糖醇氧化成各種相應(yīng)的產(chǎn)物，如有機酸、醛和酮。氧化發(fā)酵過程中氧氣的濃度深刻影響發(fā)酵的速率和生產(chǎn)率[21]。酸性產(chǎn)品在其低酸堿度的環(huán)境中使醋酸桿菌比競爭微生物更具優(yōu)勢。

醋酸桿菌的氧化發(fā)酵是通過呼吸鏈進(jìn)行的，該呼吸鏈與上面提及的有氧呼吸氧化還原電子載體類似（見圖1）。在這個過程中，電子被泛醌引導(dǎo)到末端氧化酶的分子氧中，而質(zhì)子被提取出來以產(chǎn)生質(zhì)子動力。這種質(zhì)子動力可以被ATPase利用。值得一提的是，參與氧化發(fā)酵呼吸鏈中的脫氫酶會結(jié)合特異性底物如乙醇、碳水化合物和糖醇，與還原的電子載體NADH相反[7，9-11，21]。這些酶含有一個輔基，通常是吡咯喹啉醌-酒精脫氫酶（pyrroloquinoline quinonealcohol dehydrogenase, PQQ-ADH），醌蛋白和醌蛋白細(xì)胞色素c復(fù)合物或黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性脫氫酶（（flavin adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase，F(xiàn)AD-ADH）；黃素蛋白-細(xì)胞色素c復(fù)合物）。這些脫氫酶的細(xì)胞色素亞單位負(fù)責(zé)將電子轉(zhuǎn)移到泛醌，從而將泛醌還原成泛醇[29]。

圖1 醋酸桿菌的氧化發(fā)酵過程與路徑Fig. 1 Process and pathway of oxidative fermentation of Acetobacter aceti

2.1 乙醇氧化

醋酸桿菌最著名的氧化發(fā)酵反應(yīng)之一是從乙醇生產(chǎn)乙酸（醋）。Acetobacter和Komagataeibacter都具有很強的生產(chǎn)乙酸的能力，并且這兩個屬都表現(xiàn)出對乙醇和乙酸的高抗性，這是滿足食醋工業(yè)生產(chǎn)的重要特征[30-31]。乙醇首先PQQ-ADH氧化成乙醛，乙醛進(jìn)一步被乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化成乙酸。值得關(guān)注的是ALDH對存在的氧氣水平敏感，當(dāng)氧氣濃度過低或過高時，它的活性就會下降，使乙醛在培養(yǎng)基中積累，降低乙酸的產(chǎn)率[31]。乙醇被完全氧化和耗盡時，Acetobacter，Gluconacetobacter和Komagataeibacter可以同化乙酸，并利用三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）和乙醛酸分流將其完全氧化成二氧化碳和水，這就是眾所周知的乙酸鹽“過度氧化”，這在食醋生產(chǎn)中是不利的[15，24，29]。

2.2 碳水化合物氧化

醋酸菌中的葡糖桿菌（Gluconobacter）特別擅長碳水化合物和糖醇氧化。醋酸桿菌首先通過吡咯喹啉醌-葡糖脫氫酶（pyrroloquinoline quinone-glucose dehydrogenas，PQQGDH）將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯，然后自發(fā)地或通過位于細(xì)胞質(zhì)膜中的葡糖酸內(nèi)酯酶氧化產(chǎn)生D-葡糖酸鹽。D-葡萄糖酸鹽可以被其他周質(zhì)脫氫酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酮葡萄糖酸鹽[16]。它可以被含果糖二磷酸鈉的葡萄糖酸脫氫酶氧化成2-酮-D-葡萄糖酸鹽（2-keto-D-gluconate，2-KGA），或者被吡咯喹啉醌-甘油脫氫酶（pyrroloquinoline quinoneglycerol dehydrogenase，PQQ-GLDH）氧化成5-酮-D-葡萄糖酸鹽（5-KGA）。葡萄糖濃度、酸堿度和氧化水平等因素會影響赤霉素與酮葡糖酸鹽的產(chǎn)量和比例[32-33]。如果要最大限度地提高葡萄糖酸的產(chǎn)量，就不希望將谷氨酸進(jìn)一步氧化成酮葡糖酸鹽。此外，雖然大多數(shù)醋酸菌在TCA中可以將底物完全氧化為CO2和H2O，但在葡糖桿菌中，由于缺乏琥珀酰輔酶a合成酶和琥珀酸脫氫酶，這種循環(huán)是不完全的。碳水化合物和糖醇氧化產(chǎn)物的生成使得醋酸菌能夠迅速消耗競爭微生物的碳源，同時由于酸性產(chǎn)物積累所產(chǎn)生的低pH值，也抑制了競爭微生物的生理活動[34]。

3 醋酸桿菌的解酒護肝作用

當(dāng)人體大量飲酒，酒精代謝量小于攝入量時，酒精就會在體內(nèi)短時間大量蓄積，使肝臟乙醇脫氫酶（ethanol dehydrogenase，ADH）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione sulfotransferase，GST），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的含量顯著降低，對肝臟產(chǎn)生直接損傷作用。其機制主要涉及乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛的生理損傷，氧缺乏、氧應(yīng)激、自由基的損傷以及還原性輔酶異常引起代謝紊亂等方面[35]。

人體攝入的酒精經(jīng)一系列消化器官進(jìn)行體循環(huán)，胃和腸道吸收的酒精經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，約90%的酒精在肝臟代謝（見圖2）。乙醇對人體的損傷不僅僅是其自身，還在于過量的酒精擾亂人體脂質(zhì)代謝，進(jìn)而產(chǎn)生體表發(fā)熱、臉紅、眩暈甚至腦溢血等危及生命的風(fēng)險[36]。在肝臟，乙醇主要通過ADH酶的酶解作用代謝成乙醛（過氧化氫酶、微粒體氧化酶以及黃嘌呤氧化酶僅代謝約20%）。當(dāng)過度攝入乙醇導(dǎo)致ADH活性增加，產(chǎn)生過量的NADH，刺激機體丙酮酸代謝，丙酮酸含量的降低導(dǎo)致葡萄糖分解率增加，降低了血液中血糖含量（引起低血糖，甚至死亡）、提高了乳酸的含量。乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛通過肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的ALDH催化脫氫生成乙酸[37]。過度產(chǎn)生的乙醛累積引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙以及Flush（臉部潮紅）現(xiàn)象。同時由乙醛代謝產(chǎn)生的乙酸會以乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，A-CoA）的形式參與TCA。而在此過程中H+濃度過高，促進(jìn)了肝臟脂肪酸的合成，過量脂肪合成，形成將軍肚[38]。已有研究表明，醋酸菌產(chǎn)品具有解酒護肝的作用，具體的作用機制也逐漸被關(guān)注。

圖2 酒精在人體內(nèi)消化代謝途徑及酒精中毒機制Fig. 2 Digestion and metabolism pathway of alcohol in human body and mechanism of alcoholism

3.1 促進(jìn)乙醇在胃部氧化

前面介紹已經(jīng)提到，醋酸桿菌在低酸堿度的條件下PQQ-ADH和ALDH酶依然具有酶活性，胃部是食物消化代謝的場所，正常pH值在0.9～1.8，此時醋酸桿菌與乙醇一同攝入便可以在胃部進(jìn)行部分乙醇代謝，減緩肝臟的代謝壓力和脂質(zhì)累積進(jìn)而起到解酒護肝的作用。NOMURA Y等[19]在麻醉大鼠的胃中注射體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇協(xié)同凍干醋酸菌懸液發(fā)現(xiàn)醋酸菌協(xié)同組大鼠血中乙醇濃度低于對照組（P＜0.05）。NISHIYAMA H等[34]研究發(fā)現(xiàn)，具有ADH 和ALDH 活性的醋酸菌粉末與乙醇同時攝入可降低人體呼氣和血液中的乙醇濃度。

3.2 調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝

該假說認(rèn)為具有ADH和ALDH 活性的醋酸桿菌進(jìn)入機體促進(jìn)肝臟的乙醇和乙醛的代謝，調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝酶環(huán)境，減緩了NADH和乳酸對肝臟的損傷[40-45]。陳小雪等[46]探究不同劑量醋酸桿菌對急性酒精攝入小鼠肝損傷影響，發(fā)現(xiàn)15 mg/kg和45 mg/kg的醋酸菌粉末（人體等效劑量1.2 mg/kg和3.6 mg/kg醋酸桿菌）可有效降低肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量并顯著降低了轉(zhuǎn)氨酶的含量。清野慧至等[17]通過14 dC57BL/6J小鼠攝入酒精協(xié)同醋酸桿菌實驗發(fā)現(xiàn)，醋酸桿菌抑制了轉(zhuǎn)氨酶的升高和脂質(zhì)的堆積、改善肝臟纖維化，達(dá)到了解酒效果。

3.3 調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激

細(xì)菌蛋白表達(dá)的整體變化研究表明ALDH在暴露于環(huán)境和化學(xué)應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)會上調(diào)，這種上調(diào)是細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)途徑。亞砷酸鹽（As3+）暴露通過破壞檸檬酸循環(huán)和釋放未結(jié)合的Fe2+誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，然后通過芬頓反應(yīng)誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[47]。假單胞菌暴露于亞砷酸鹽會導(dǎo)致幾種蛋白質(zhì)的上調(diào)，包括預(yù)測的乙醛脫氫酶家族1P蛋白家族1（acetaldehyde dehydrogenase-protein family-1，ALDH1P1），當(dāng)暴露于斑銅礦石（Cu5FeS4）時，硫桿菌上調(diào)未知的ALDH（ALD1Q1）（NCBI基因ID：198283897）[48]。田思敏等[49]研究發(fā)現(xiàn)，使用日本丘比株式會社“YOITOKI”醋酸桿菌膠囊（醋酸桿菌45 mg/膠囊，人體推薦量2粒/日）對急性酒精攝入小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，顯著提高了還原型谷胱甘肽的含量。JIANG X等[50]灌胃小鼠醋酸桿菌協(xié)同28%酒精發(fā)現(xiàn)顯著降低了丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、提高了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的含量，改善了氧化應(yīng)激水平。因此可以假設(shè)當(dāng)酒精過度攝入引起機體氧化應(yīng)激時，同時可以激活醋酸菌中的ALDH對氧化應(yīng)激的應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)醛類物質(zhì)的生成與代謝，協(xié)同達(dá)到保護肝臟的作用。

4 結(jié)論與展望

本文對醋酸桿菌生理代謝過程、解酒護肝療效、解酒途徑進(jìn)行相關(guān)綜述并對解酒機制進(jìn)行歸納與總結(jié)。發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌解酒護肝效果體現(xiàn)在醋酸桿菌中PQQ-ADH和ALDH酶及其顯著的催化乙醇氧化作用中。醋酸菌科屬種較多，其中醋酸桿菌屬和葡糖醋酸桿菌屬已有深入研究，無論是醋酸菌的培養(yǎng)基質(zhì)、菌種貯藏還是劑型研究都較為完整，而對醋酸菌有氧代謝涉及的酶相關(guān)基因水平研究還不夠透徹。對于醋酸桿菌解酒機制，主要是從乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶入手，雖然相關(guān)研究比較少，研究程度也比較淺，但是由于具體的分子機制牽涉廣泛，還需要各方面專家學(xué)者聯(lián)合研究以期找到醋酸桿菌解酒護肝是否通過脫氫酶作用機制，為臨床指導(dǎo)安全用藥及相關(guān)研究提供參考意義。