水孔蛋白-5在機(jī)械通氣致急性肺損傷大鼠肺組織中的表達(dá)研究*

陳美羽，趙毓靜，張新日

（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸與危重癥學(xué)科，山西 太原030001）

慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸衰竭等疾病是呼吸系統(tǒng)常見病，臨床通過機(jī)械通氣進(jìn)行呼吸支持治療，維持患者血氧飽和度。但機(jī)械通氣時(shí)間過長，通氣量過大，可出現(xiàn)機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷，對肺組織造成二次打擊，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury, ALI）或急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生。ALI 主要病理生理特征是彌漫性肺泡水腫和肺泡液清除率下降，肺泡上皮細(xì)胞損傷和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，肺泡腔內(nèi)富集含蛋白和炎癥細(xì)胞因子的水腫液，破壞肺泡細(xì)胞表面氣液交換屏障的平衡，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生[1-2]。

水孔蛋白-5（Aquaporin-5, AQP-5）位于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，是調(diào)節(jié)水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能性蛋白，生理狀態(tài)下可協(xié)助清除肺泡腔內(nèi)多余水分，保持肺泡腔干燥環(huán)境[3]。但AQP-5 在ALI 過程中對水腫液清除作用的機(jī)制仍不明確。多項(xiàng)研究顯示[4-7]，不同類型損傷因素致ALI 條件下，AQP-5 表達(dá)趨勢不穩(wěn)定。本研究通過大潮氣量機(jī)械通氣快速復(fù)制大鼠ALI 模型[8]，觀察在不同的機(jī)械通氣時(shí)間下，AQP-5 在肺組織中表達(dá)的變化，探討其在機(jī)械通氣致ALI 中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康雄性SD大鼠30只，體重270～320 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK（晉）2015-0001]。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗鼠AQP-5 一抗（武漢博士德生物公司，編號(hào)：BA2205），SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒[即用型SABC-POD（兔IgG），武漢博士德生物公司，編號(hào)：SA1022]，RWD407 型小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳瑞沃德公司）。

1.3 方法

將30 只大鼠按照不同的機(jī)械通氣時(shí)間，完全隨機(jī)分為對照組、0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h組，每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自由飲水。大鼠稱重并記錄，用于計(jì)算麻醉劑量和肺系數(shù)。水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位置于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，頸前剪毛備皮消毒，沿頸部正中縱向切開約1.5 cm，逐層鈍性分離皮膚及皮下肌肉組織，暴露氣管。

對照組大鼠行氣管切開，保持氣道通暢，自由呼吸室內(nèi)空氣（吸氧濃度21%），不給予機(jī)械通氣。2 h 后行常規(guī)胸、腹部消毒，逐層打開腹腔并暴露腹主動(dòng)脈，迅速放血處死，處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)?？焖俅蜷_胸腔，鈍性分離組織取出肺臟，立即置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗2、3 次，用無菌紗布吸干肺表面水分。留取肺大體標(biāo)本，用于觀察肺組織大體形態(tài)損傷程度；取右肺稱濕重，用于計(jì)算肺系數(shù)，評估肺組織水腫程度；取左肺于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后進(jìn)行HE 染色和免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察肺組織損傷程度和檢測各組肺組織中AQP-5 的表達(dá)。

0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠行氣管切開后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸室內(nèi)空氣（吸氧濃度21%），分別給予機(jī)械通氣0.5 h、1.0 h、1.5 h 和2.0 h，4組呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置一致：VT=30 ml/kg，I∶E為1∶1，PEEP為0 cmH2O，RR為60次/min。4 組大鼠機(jī)械通氣結(jié)束后立即處死留取標(biāo)本，處置方法同對照組大鼠。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 HE 和免疫組織化學(xué)各組大鼠肺組織經(jīng)過多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明石蠟包埋冷卻，制成4 μm 厚切片，過夜烤片。HE 染色：二甲苯、酒精梯度進(jìn)行組織脫蠟，蘇木精-伊紅染色，酒精、二甲苯梯度脫水，風(fēng)干后樹膠封片，光鏡下觀察各組肺組織損傷程度。免疫組織化學(xué)：組織脫蠟，枸櫞酸鹽高壓抗原熱修復(fù)，5%BSA封閉液封閉，孵育兔抗鼠AQP-5 一抗（1∶100）37℃1 h，SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片，光鏡下觀察并評估各組肺組織中AQP-5 的表達(dá)。

1.4.2 肺系數(shù)通過肺系數(shù)顯示肺組織水腫損傷程度。分別稱量機(jī)械通氣前大鼠體重和右肺組織重量，計(jì)算肺系數(shù)：肺濕重（g）/體重（kg）×100%，肺系數(shù)越大表示肺水腫程度越嚴(yán)重。

1.4.3 AQP-5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定方法采用染色強(qiáng)度評分和AQP-5 陽性細(xì)胞占比評分[9]判定AQP-5 染色結(jié)果。每組取6 張切片，每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，以肺泡上皮細(xì)胞頂膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。首先按照染色強(qiáng)度評分：棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淺黃色為1 分，無色為0 分；再按陽性細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞的百分比評分：＞75% 為4 分，75%～＞50% 為3 分，50%～＞10%為2分，≤10%為1分，陰性為0分。評分越高表示肺組織中AQP-5表達(dá)越多。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織大體標(biāo)本

對照組大鼠肺組織大體標(biāo)本體積正常，表面光滑，色澤粉嫩，質(zhì)軟（見圖1A）；與對照組比較，0.5 h組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠肺組織體積增大，肺葉邊緣外翻，有彌漫性出血，質(zhì)韌（見圖1B～E 中箭頭所示）。表明機(jī)械通氣時(shí)間的延長對肺組織大體形態(tài)改變有影響。

圖1 各組大鼠肺組織大體標(biāo)本

2.2 各組大鼠肺系數(shù)比較

各組大鼠肺系數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，1.0 h 組和1.5 h組大鼠肺系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各組大鼠肺系數(shù)組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

對照組大鼠肺泡腔大小正常，形態(tài)規(guī)整，肺泡壁完整、無炎癥細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)無水腫（見圖2A）；與對照組比較，0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組和2.0 h組大鼠肺泡壁可見不同程度破裂、肺大泡形成，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞及粉紅色水腫液滲出，肺間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤（見圖2B～E 中箭頭所示），為典型ALI 病理形態(tài)學(xué)特征，表明機(jī)械通氣致大鼠ALI 模型復(fù)制成功。

2.4 各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組大鼠肺組織染色均勻一致、呈棕褐色（見圖3A）；與對照組比較，0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠肺組織染色不均勻，呈現(xiàn)棕黃色、淺黃色，AQP-5 表達(dá)逐漸減少甚至無（見圖3B～E 中箭頭所示）。表明機(jī)械通氣時(shí)間對肺組織中AQP-5 表達(dá)有顯著影響。

表1 各組大鼠肺系數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠肺系數(shù)比較 （n=6，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與0.5 h組比較，P ＜0.05；③與1.0 h組比較，P ＜0.05；④與1.5 h組比較，P ＜0.05。

肺系數(shù)組別1.18±0.035 2.24±0.119①3.33±0.072①②3.41±0.202①②4.03±0.200①②③④376.693 0.001對照組0.5 h組1.0 h組1.5 h組2.0 h組F 值P 值

圖2 各組大鼠肺組織病理切片HE染色圖 （×100）

圖3 各組大鼠肺組織病理切片免疫組織化學(xué)染色圖 （×100）

2.5 各組大鼠肺組織AQP-5 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞占比評分比較

各組大鼠肺組織AQP-5 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評分和AQP-5 陽性細(xì)胞占比評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，1.0 h 組和1.5 h 組AQP-5 染色強(qiáng)度評分和AQP-5陽性細(xì)胞占比評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各組AQP-5 染色強(qiáng)度評分和AQP-5 陽性細(xì)胞占比評分兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.6 肺系數(shù)與AQP-5 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞占比評分的相關(guān)性

肺系數(shù)與AQP-5 免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評分呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.925，P=0.001）；肺系數(shù)與免疫組織化學(xué)AQP-5 染色陽性細(xì)胞占比評分之間呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.951，P=0.001）。

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)AQP-5染色評分比較（n=6，±s）

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)AQP-5染色評分比較（n=6，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與0.5 h組比較，P ＜0.05；③與1.0 h組比較，P ＜0.05；④與1.5 h組比較，P ＜0.05。

組別染色強(qiáng)度評分陽性細(xì)胞占比評分對照組0.5 h組1.0 h組2.50±0.13①1.40±0.26①②3.60±0.18①2.40±0.16①②1.5 h組2.0 h組F 值P 值2.80±0.11 1.30±0.18①②0.40±0.22①②③④207.522 0.001 3.80±0.13 2.20±0.19①②0.70±0.27①②③④216.311 0.001

3 討論

水孔蛋白家族被發(fā)現(xiàn)以來，已有13 種AQPs 亞型，特異性分布于人體各器官組織中[10]。AQPs 的分子量約28 kD，是一種含有胞質(zhì)N-始端和C-末端的跨膜通道蛋白，由H1～H6 6 個(gè)跨膜片段組成，兩兩間相互靠近，共形成A～E 5 個(gè)“環(huán)區(qū)”。B 區(qū)和E 區(qū)反向平行接近形成“沙漏模型”，即疏水孔。中心孔開關(guān)的活性由門控或細(xì)胞膜中AQPs 的豐度來調(diào)節(jié)，這種縮窄性空間構(gòu)型決定了水孔的滲透選擇性[11]。

在肺組織中，AQP-5 表達(dá)于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞頂膜近換氣側(cè)，水分子的轉(zhuǎn)移依賴跨肺泡上皮和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透梯度完成[3,11]。MA[5]發(fā)現(xiàn)敲除AQP-5基因，肺泡透水性較生理狀態(tài)下可降低10倍，表明AQP-5 介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。劉洋等[6]發(fā)現(xiàn)在不同潮氣量機(jī)械通氣中，大潮氣量組肺組織中AQP-5 表達(dá)量下調(diào)，可能與肺水腫發(fā)生機(jī)制有關(guān)。可見，AQP-5 的表達(dá)與急性肺水腫互為因果，相互促進(jìn)。PIRES-NETO等[7]研究結(jié)果顯示，AQP-5 的表達(dá)量在不同病因致急性呼吸衰竭患者的肺組織中均增加，認(rèn)為AQP-5 對肺損傷的反應(yīng)可能隨時(shí)間波動(dòng)，并與肺損傷的強(qiáng)度和類型有關(guān)。本研究采用大潮氣量機(jī)械通氣誘導(dǎo)大鼠ALI，研究結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，隨著通氣時(shí)間延長，各機(jī)械通氣組肺組織體積逐漸增大，光鏡下可見肺泡壁破裂、肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)水腫液滲出、炎癥細(xì)胞浸潤等細(xì)胞形態(tài)學(xué)的損傷程度逐漸加重，肺系數(shù)逐漸升高，提示肺水腫程度逐漸增加；而AQP-5 在肺組織中的表達(dá)逐漸減少。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺系數(shù)與肺組織AQP-5免疫組織化學(xué)染色評分呈負(fù)相關(guān)。

FABREGAT 等[12]發(fā)現(xiàn)在低潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織中，AQP-5表達(dá)隨著暴露時(shí)間的延長而增加，肺水腫程度逐漸減輕，認(rèn)為AQP-5 對肺組織有保護(hù)作用。在本研究中值得關(guān)注的是，1.0 h 組和1.5 h 組肺系數(shù)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以反映出在持續(xù)機(jī)械通氣過程中，肺水腫加重程度呈現(xiàn)短暫的緩慢趨勢。結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果，1.0 h 組和1.5 h 組AQP-5 染色強(qiáng)度評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AQP-5 在1.0 h 組和1.5 h 組肺泡上皮細(xì)胞膜的表達(dá)僅占對照組肺組織細(xì)胞的50%左右，這部分肺組織中的AQP-5 可能對肺泡水腫液清除存在代償機(jī)制，減緩肺水腫的進(jìn)一步發(fā)生。但這種代償機(jī)制并非持續(xù)作用，隨著通氣時(shí)間延續(xù)到2 h，肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮完整性破壞嚴(yán)重，AQP-5 表達(dá)下降，AQP-5 對水通量的調(diào)節(jié)超過正常轉(zhuǎn)運(yùn)限度，對肺水清除出現(xiàn)失代償。由此可見，AQP-5 參與機(jī)械通氣致肺水腫的發(fā)生、發(fā)展，對肺泡水腫液的及時(shí)清除和吸收起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，隨著機(jī)械通氣時(shí)間延長，肺水腫程度逐漸加重，肺組織中AQP-5 表達(dá)逐漸減少，表明AQP-5參與機(jī)械通氣致肺水腫的發(fā)生、發(fā)展。