布魯氏菌病不同血清學(xué)檢測方法結(jié)果分析

王 斌，王淑芳，白天俊，何金桂

(天祝縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天祝 733299)

布魯氏菌病(Brucellosis,以下簡稱布病)是一種由布魯氏菌引起的嚴(yán)重危害人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患傳染病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和我國將其列為二類動(dòng)物疫病。據(jù)報(bào)道全球每年發(fā)病人數(shù)在50萬以上。染疫的家畜是人間布病的主要傳染源，人由于接觸患病的牲畜及其產(chǎn)品或其污染物而感染布病。近幾年，我國人、畜間布病疫情呈增長事態(tài)，雖然不同地區(qū)采取了不同的防控措施，但布病檢出率還是高高低低，沒有明顯下降趨勢。

布病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有許多種，包括細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測和血清學(xué)檢測。前兩種方法耗時(shí)長、費(fèi)力、環(huán)境要求高、成本也高，不適合臨床檢測和調(diào)運(yùn)檢疫檢測，因此基層檢測布病主要用血清學(xué)方法。布魯氏菌侵入機(jī)體后，不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，所以檢測血液里的特異性抗體對(duì)診斷有重要意義，目前應(yīng)用比較多的血清學(xué)診斷方法有3種，即虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)(RBT)、試管凝集實(shí)驗(yàn)(SAT)、ELISA抗體檢測，ELISA檢測目前有競爭(cELISA)和間接ELISA(iELISA)兩種方法，其中SAT是我國以往確診布病方法之一。幾種方法各有優(yōu)劣，敏感度和特異性都不同，為了找出更適合牛羊布病臨床檢測的方法，筆者選用SAT、RBT、cELISA 3種方法檢測幾群流產(chǎn)羊群布病抗體，并作對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 血清來源

收集2年內(nèi)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)流產(chǎn)羊群采集的血清共260份，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

RBT和SAT抗原及陰陽對(duì)照血清均來自哈藥集團(tuán)生物有限公司，稀釋液自配；cELISA為布魯氏菌競爭ELISA抗體檢測試劑盒，廠家為廣州悅洋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測方法

檢測方法均采用GB/T 18646—2018規(guī)定和試劑盒要求。

1.3.1 RBT 先將樣品和陰陽血清及抗原恢復(fù)到室溫，混勻抗原和血清，分別吸取25μL加于反應(yīng)板上，用移液器吸頭快速混勻血清和抗原，涂成圓形，4 min內(nèi)在自然光下觀察。陰陽對(duì)照結(jié)果成立時(shí)方可判斷。4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象這判斷為陽性，無凝集現(xiàn)象者判斷為陰性。

1.3.2 SAT 配制0.5%石碳酸的10%氯化鈉溶液作稀釋液。每份血清用4支凝集試管，第1管加920 μL稀釋液，第2～4管各加入500 μL稀釋液，然后取血清80 μL加入到第1管內(nèi)，混勻后吸取500 μL加入到第2管，并充分混勻，如此倍比稀釋到第4管，從第4管棄去混勻液500 μL。然后每管加入試管凝集抗原500 μL，同時(shí)作陰陽對(duì)照管和抗原對(duì)照管、比濁管，將各試管混勻后放置37℃恒溫箱內(nèi)孵育18～24 h，判斷以1∶50血清稀釋度出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，判定為陽性，1∶25血清稀釋度出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，判定為可疑，無凝集現(xiàn)象者判為陰性。

1.3.3 cELISA 試劑盒恢復(fù)到室溫后取出抗原包被板，以1x洗滌液洗滌1次并拍干，將血清和陰陽對(duì)照分別以50 μL加入到ELISA板，再每孔加入50 μL已稀釋好的單克隆抗體，混勻5 min，37 ℃孵育30 min。用洗滌液洗板3次拍干，再加入稀釋好的羊抗鼠酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃孵育30 min,再次洗板3次，然后加入底物液各50 μL，室溫避光反應(yīng)15 min,再每孔加終止液50 μL，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定OD450nm。

結(jié)果判斷：當(dāng)樣品的PI≥30%時(shí)，為布病抗體陽性，樣品PI<30%時(shí)，為布病抗體陰性。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用Kappa一致性評(píng)測方法統(tǒng)計(jì)3種結(jié)果的一致性。按照標(biāo)準(zhǔn)，Kappa系數(shù)的強(qiáng)弱代表一致性的強(qiáng)弱，系數(shù)越大，代表一致性越強(qiáng)。當(dāng)k值<0，表示一致性極差，K值>0.6，表示一致性相當(dāng)可靠，當(dāng)k值為0.81～1.0時(shí)，表示一致性極強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

按照布病防治技術(shù)規(guī)范，RBT檢測陽性而SAT陰性的，經(jīng)30 d后再采樣檢測，轉(zhuǎn)陽的或仍然可疑的按照陽性判斷，對(duì)樣品中可疑的重新采樣檢測，轉(zhuǎn)陰的，按照陰性判斷。2018版診斷技術(shù)規(guī)定SAT和cELISA都可為布病確診標(biāo)準(zhǔn)，所以筆者以SAT和cELISA為標(biāo)準(zhǔn)，RBT與它們對(duì)比結(jié)果假陽性率、假陰性率、符合率、敏感度、特異度和Kappa值，形成結(jié)果見表1、表2，SAT與cELISA對(duì)比一致性和K值，結(jié)果見表3。

表1 RBT與SAT檢測結(jié)果對(duì)比

表2 cELISA與RBT檢測結(jié)果對(duì)比

表3 SAT與cELISA檢測結(jié)果對(duì)比

2.1 分析3種檢測方法的一致性

三者的符合率均在88.8%以上，用Kappa值檢驗(yàn)，K值均大于0.76(0.76～0.88)，說明三者有較高的一致性，其中cELISA與RBT結(jié)果相比K值最高，達(dá)到0.88，符合率也高達(dá)94.6%，而RBT與SAT檢測結(jié)果K值差點(diǎn)，低了0.12。

2.2 分析三者的敏感度和特異度

以RBT檢測結(jié)果對(duì)比其他兩者結(jié)果，cLEISA的敏感度高于SAT，達(dá)到了100%，特異性也高出SAT6.6個(gè)百分點(diǎn)。如果以SAT作為標(biāo)準(zhǔn)判定，RBT的假陽性達(dá)到14.9%，容易誤判假陽性畜，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，如果以cELISA為標(biāo)準(zhǔn)，CELISA的陽性檢出率在兩者之間，高于SAT低于RBT。RBT的假陽性率比前者低為8.23，低了7.57個(gè)百分點(diǎn)，誤判假陽性畜的比例低，并且特異性達(dá)到91.7%，高于表1組，說明漏檢幾率也更低。

2.3 SAT與cELISA檢測結(jié)果對(duì)比分析

雖然從表3看兩者K值達(dá)到0.85，呈高度一致性，符合率為93.5%，但還是有些差別，沒有完 全一致。

3 討 論

3種檢測方法中，RBT方法簡單快速易操作，是豬、牛、羊布魯氏菌病檢疫的國標(biāo)方法。但是溶血現(xiàn)象、交叉反應(yīng)和超過4 min容易出現(xiàn)纖維素的凝集塊等原因會(huì)造成假陽性的凝集，導(dǎo)致假陽性較高，特異性不強(qiáng)，容易誤判假陽性畜，也無法區(qū)分野毒感染抗體和免疫抗體，致使RBT不能作為確診判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。SAT法能定量檢測抗體的凝集滴度，尤其對(duì)感染初期產(chǎn)生的IgM比較敏感，能很好地檢測感染初期和疫苗免疫后血清抗體的早期診斷，特異性也強(qiáng)，但檢測耗時(shí)長，需要20 h以上，判斷時(shí)受主觀因素影響大，不適合大批量檢疫檢測使用。ELISA法檢測，可根據(jù)最后一步顏色的深淺定性或定量判斷。據(jù)報(bào)道，ELISA法檢測lgG敏感度高，已被OIE定為判斷方法之一[2]。cELISA適合牛種、羊種和豬種布魯氏菌病的血清學(xué)診斷，從以上實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，cELISA與其他兩種方法有高度一致性，敏感度和特異性都強(qiáng)，耗時(shí)達(dá)2 h左右，操作方便，與SAT相比更適合臨床使用，即先用RBT廣泛篩選，再用cELISA確診，尤其針對(duì)種畜檢測，可避免誤判假陽性畜和假陰性畜，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失和生物安全危害。