誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療青光眼的研究進(jìn)展

談思益 綜述，康偉超 審校

(徐州醫(yī)科大學(xué)：1.第二臨床醫(yī)學(xué)院；2.麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

人眼是人體結(jié)構(gòu)中最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)之一，由數(shù)百萬(wàn)個(gè)具有不同細(xì)胞類型的組織構(gòu)成。眼睛在解剖學(xué)上可分為前部和后部。前部包含角膜、虹膜、瞳孔和晶狀體，后部則由鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、黃斑和視神經(jīng)組成。光線通過(guò)角膜和晶狀體進(jìn)入眼內(nèi)，位于眼后的視網(wǎng)膜將聚焦的光的輸入轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的模式，然后傳輸?shù)酱竽X形成周圍環(huán)境的視覺(jué)圖像，但視覺(jué)處理的第一步發(fā)生在視網(wǎng)膜。

1 視網(wǎng)膜發(fā)育的過(guò)程

視網(wǎng)膜起源于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育形成的神經(jīng)外胚層，因此，視網(wǎng)膜也被認(rèn)為是大腦的一部分[1]。超過(guò)30%的大腦功能是分析眼睛攜帶的光的信息[2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)是視網(wǎng)膜中最先出現(xiàn)的細(xì)胞類型之一，緊隨其后的是無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、視錐細(xì)胞和水平細(xì)胞。在視網(wǎng)膜發(fā)育的后期，產(chǎn)生桿狀細(xì)胞，接著是雙極細(xì)胞，最后是Müller膠質(zhì)細(xì)胞。RGC位于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中的最內(nèi)層，光感受器則更多地占據(jù)外圍層。一些細(xì)胞外信號(hào)分子調(diào)節(jié)眼的發(fā)育過(guò)程，包括Wnt[3]、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)[4]、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)[5]、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、維甲酸(RA)[6]。這些細(xì)胞外信號(hào)分子在發(fā)育的不同階段出現(xiàn)，以調(diào)節(jié)一系列不同的發(fā)育事件。RGC是連接到大腦軸突的小神經(jīng)元，將光信號(hào)發(fā)送到大腦指定區(qū)域，如外側(cè)膝狀核或視上丘，作為視網(wǎng)膜的最終輸出[7-8]。因此，RGC有更大的細(xì)胞體和更粗的軸突，這都是動(dòng)作電位遠(yuǎn)距離傳播所必需的[9-10]。這些軸突在神經(jīng)纖維層中聚集在一起形成視神經(jīng)。RGC在將視覺(jué)信息從眼睛傳遞到大腦中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)RGC的傳導(dǎo)因疾病或損傷被切斷，從而抑制光信息到達(dá)適當(dāng)?shù)奶幚碇行?，進(jìn)而導(dǎo)致視力喪失和失明。

2 青光眼疾病的特點(diǎn)

青光眼是一組以RGC進(jìn)行性退化為特征的視網(wǎng)膜疾病，是不可逆轉(zhuǎn)失明的主要原因之一。據(jù)估計(jì)，全球有超過(guò)7 600萬(wàn)人受青光眼影響，2040年影響約1.118億人[11]。我國(guó)40歲以上人群青光眼患病率為1.5%～3.6%[12]。盡管青光眼在全球普遍流行，但目前還沒(méi)有有效的治療方法來(lái)治療RGC的退化和隨后的視野損傷。目前針對(duì)青光眼的治療大多數(shù)都旨在降低眼壓來(lái)限制視力喪失的進(jìn)展，因?yàn)楦哐蹓菏乔喙庋畚ㄒ淮_認(rèn)的可改變的危險(xiǎn)因素[13]。然而青光眼也可以在正常眼壓下發(fā)生[14]，所以降低眼壓不能有效防止視力喪失。因此針對(duì)RGC退變及視力損傷機(jī)制的研究，以及RGC的移植替代研究具有重要的意義。

各種用于治療青光眼的細(xì)胞療法正在研究當(dāng)中。青光眼明顯的表現(xiàn)是RGC的丟失。傳統(tǒng)對(duì)抗RGC變性的方法是依賴于在疾病過(guò)程的早期階段進(jìn)行治療，此時(shí)神經(jīng)保護(hù)仍然有效。實(shí)際上大多數(shù)視神經(jīng)病變患者在診斷時(shí)已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的RGC丟失，并且在疾病的后期階段，大量不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞丟失使得神經(jīng)保護(hù)變得徒勞。在這種情況下，移植健康的RGC以取代退化的細(xì)胞是恢復(fù)視覺(jué)功能的最后選擇。然而，由于RGC軸突的遠(yuǎn)距離投射及有效地恢復(fù)突觸的功能性等障礙，RGC的替代策略一直缺乏成功的發(fā)展。目前干細(xì)胞療法已經(jīng)在帕金森病和脊髓損傷等神經(jīng)退行性疾病中被證明具有改善作用，治療的成功在于對(duì)損傷、丟失的神經(jīng)元進(jìn)行替換。實(shí)際上，由于人眼是脊椎動(dòng)物體內(nèi)的免疫優(yōu)勢(shì)部位，因此一直處于干細(xì)胞移植研究的前沿[15]。移植細(xì)胞的免疫排斥問(wèn)題是決定移植后細(xì)胞能否在宿主體內(nèi)存活并良好整合的關(guān)鍵。而由于血-眼屏障、眼內(nèi)腔的免疫抑制微環(huán)境和前房相關(guān)的免疫偏離存在使眼具有了獨(dú)特的免疫赦免條件。此外，移植細(xì)胞的作用機(jī)制不僅在于完成細(xì)胞整合和補(bǔ)充的任務(wù)，還在于提供神經(jīng)保護(hù)環(huán)境，產(chǎn)生生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，減緩神經(jīng)退變過(guò)程，恢復(fù)視功能。

3 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)志物

RGC功能特性可作為鑒別和純化篩選細(xì)胞的依據(jù)之一。RGC具有對(duì)谷氨酸做出反應(yīng)的能力[16-17]，還表現(xiàn)出興奮性突觸后電位(EPSPs)[18]。在分化培養(yǎng)中為了將RGC與其他類型的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，使用一些分子標(biāo)記可以將其識(shí)別出來(lái)。早期使用遺傳標(biāo)記TUJ1作為RGC樣細(xì)胞的共同標(biāo)記[19]，RGC表達(dá)這種標(biāo)記，但不具有特異性，因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中也有許多投射神經(jīng)元表達(dá)此標(biāo)記[20]。用于識(shí)別RGC的最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子是BRN3。BRN3由視網(wǎng)膜內(nèi)的RGC特異性表達(dá)。然而，BRN3的表達(dá)也存在于體感神經(jīng)元和聽(tīng)神經(jīng)元中[21]。免疫熒光是一種純化RGC的技術(shù)，其利用RGC表達(dá)的表面抗原Thy-1的RGC特異性表達(dá)。使用兩步法，可以從出生后的大鼠視網(wǎng)膜獲得99.5%以上純度的RGC培養(yǎng)[22]。雖然Thy-1特異性地表達(dá)在視網(wǎng)膜內(nèi)的RGC中，但這個(gè)標(biāo)記在神經(jīng)系統(tǒng)的許多其他類型的神經(jīng)元中都有表達(dá)[23]。因此，必須注意不能僅僅依靠一個(gè)標(biāo)記鑒別,而應(yīng)該結(jié)合遺傳標(biāo)記、形態(tài)特征和功能特征的組合表達(dá)才能鑒別RGC。目前關(guān)于RGC發(fā)育和成熟的研究發(fā)現(xiàn)RGC具有多樣性，在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)和鑒定了30多種在分子、形態(tài)和生理特性上不同的亞型[24]。這些亞型表達(dá)特定的分子標(biāo)記，具有不同的分子、結(jié)構(gòu)和功能特征[24]。雖然在動(dòng)物模型中已經(jīng)觀察到大多數(shù)RGC亞型，但最近有研究在人類多能干細(xì)胞(hPSC)分化得到的RGC中也發(fā)現(xiàn)了不同亞型的存在[25]。這些動(dòng)物研究不僅描述了這許多亞型的復(fù)雜性，還觀察了急性損傷或疾病后不同亞型的存活和再生現(xiàn)象[26]。接下來(lái)應(yīng)該集中于如何將特定的亞型從hPSC中區(qū)分出來(lái)，以便正確理解不同視神經(jīng)疾病中特定RGC亞型的退變情況，為今后在細(xì)胞替代研究和治療中解決退行性細(xì)胞丟失問(wèn)題提供更多的了解。

4 視網(wǎng)膜移植細(xì)胞的來(lái)源

目前用于移植的各種細(xì)胞來(lái)源大致可分為成體組織來(lái)源的干細(xì)胞、胚胎來(lái)源的干細(xì)胞、祖細(xì)胞和多能干細(xì)胞。多能干細(xì)胞(PSC)目前被認(rèn)為是最好的細(xì)胞來(lái)源，hPSCs可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜再生所需的所有細(xì)胞類型[27]。2006年，TAKAHASHI等[28]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)幾乎可以從人體的任何細(xì)胞中人工地制造出來(lái)，并具有與胚胎干細(xì)胞相同的功能，如無(wú)限增殖、自我更新和分化為3個(gè)胚層的能力。iPSCs可以提供自體干細(xì)胞的來(lái)源，而不需要考慮使用胚胎干細(xì)胞需要破壞胚胎的倫理問(wèn)題。因此，iPSCs非常適合用于干細(xì)胞移植和體外疾病模型的建立。對(duì)于iPSC分化的過(guò)程包括2個(gè)步驟：首先細(xì)胞失去其特有的特征，呈現(xiàn)出一種較低分化程度的狀態(tài)；其次，細(xì)胞分化過(guò)程重新啟動(dòng)，通過(guò)特定的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子的參與，開(kāi)始新的分化過(guò)程。

5 細(xì)胞移植面對(duì)的問(wèn)題

5.1形成腫瘤 PSC的使用也會(huì)產(chǎn)生形成腫瘤的問(wèn)題。未分化的iPSC可以存在于分化的細(xì)胞集落中，一同移植可能會(huì)導(dǎo)致畸胎瘤的形成。因此需要提高移植細(xì)胞的純度，來(lái)避免移植后畸胎瘤的形成。

5.2細(xì)胞數(shù)量 雖然各種分化方法都可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)元，但這些方法中大多數(shù)仍然不能大量地產(chǎn)生除視桿細(xì)胞以外的特定視網(wǎng)膜神經(jīng)元。因?yàn)轶w外干細(xì)胞培養(yǎng)方法模擬了在體內(nèi)正常視網(wǎng)膜發(fā)育的過(guò)程，并且在小鼠和人的視網(wǎng)膜中，視桿細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)RGC[29]。干細(xì)胞來(lái)源的RGC的平均產(chǎn)量估計(jì)為培養(yǎng)細(xì)胞的0.1%～30.0%，這與不同發(fā)育階段視網(wǎng)膜中RGC的正常比例相似。

5.3突觸形成 RGC作為視網(wǎng)膜的投射神經(jīng)元，需要將長(zhǎng)軸突延伸出眼睛，進(jìn)入大腦并形成突觸，并正確地連接到突觸后靶點(diǎn)。RGC軸突受限于眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間限制，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)向外延伸到特定靶點(diǎn)的特性。

5.4免疫反應(yīng) 雖然，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)在許多類型的干細(xì)胞中的表達(dá)很低，但分化的組織表達(dá)MHC，這種表達(dá)會(huì)導(dǎo)致免疫排斥。即使是自體小鼠iPSC也可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生類似自身免疫反應(yīng)。最大限度地減少手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)于減少固有免疫(如自然殺傷細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)的激活具有重要的意義，固有免疫反過(guò)來(lái)可以激活獲得性免疫反應(yīng)。

6 iPSC的應(yīng)用

iPSC為研究人類視網(wǎng)膜退行性疾病提供了一個(gè)獨(dú)特的工具，包括青光眼等以RGC為靶點(diǎn)的視神經(jīng)疾病。由于RGC連接眼睛和大腦之間視覺(jué)信息的傳遞，它們的退化會(huì)導(dǎo)致視力喪失，最終導(dǎo)致失明。在過(guò)去，動(dòng)物模型如貓、狗、雞、豬，特別是嚙齒動(dòng)物，被用來(lái)研究一些視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的致病機(jī)制，使我們對(duì)疾病的許多關(guān)鍵方面有了更多了解[30]，但有時(shí)由于物種之間的差異使得在臨床環(huán)境下移植到人類身上時(shí)會(huì)失敗[31]。例如，老鼠是夜間活動(dòng)的動(dòng)物，它們的視網(wǎng)膜主要由視桿細(xì)胞組成，光感受器僅含有少量的視錐細(xì)胞(所有光感受器的3%)，這與人類視網(wǎng)膜存在顯著差異。并且，人類的眼睛在許多方面都是獨(dú)一無(wú)二的，例如密集斑點(diǎn)和三原色的組成。因此，并不是所有的疾病和藥物反應(yīng)都能在動(dòng)物模型中得到充分反映。iPSC衍生的RGC模型是篩選能夠改善疾病藥物高度相關(guān)的，與在動(dòng)物模型上的測(cè)試相比，在臨床上具有更高的成功潛力。

以人類來(lái)源的疾病模型發(fā)展，可以產(chǎn)生和研究患者特有的細(xì)胞。許多基于hPSC的RGC變性的遺傳模型，例如青光眼變性在過(guò)去幾年中已經(jīng)發(fā)展起來(lái)[32]，包括Six6、TANK結(jié)合激酶1(TBK1)和視神經(jīng)磷酸酶(OPTN)的突變，這些都與家族性正常眼壓性青光眼(NTG)的發(fā)病有關(guān)。Six6因其在眼睛發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中的作用而廣為人知，盡管這種轉(zhuǎn)錄因子的突變也被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致NTG的發(fā)生[33]。來(lái)自Six6錯(cuò)義突變患者的hPSC產(chǎn)生神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的效率低下，關(guān)鍵發(fā)育基因的表達(dá)減少和表達(dá)失調(diào)[34]。此外，Six6錯(cuò)義突變患者RGC表現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育、形態(tài)和電生理缺陷，軸突生長(zhǎng)減少，軸突引導(dǎo)分子表達(dá)不足。此外，Six6錯(cuò)義突變的RGC表現(xiàn)出明顯更高的活化caspase-3水平。據(jù)推測(cè)，Six6中的這種錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致RGC發(fā)育缺陷，這可能會(huì)使這些RGC在成年后面臨更高的退化風(fēng)險(xiǎn)。這些研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)新的視網(wǎng)膜退行性疾病治療方法提供了更多的思路，如果使用得當(dāng)，基于PSC的視網(wǎng)膜模型對(duì)于深入了解許多疾病方面是有益的。

從患者來(lái)源的人iPSC生成個(gè)性化視網(wǎng)膜細(xì)胞也為個(gè)性化藥物治療提供了新的可能性。hPSC定向分化的RGC也為大規(guī)模的藥物篩選提供了大量細(xì)胞，然后可以特異性地針對(duì)RGC來(lái)評(píng)估化合物對(duì)疾病的療效。

7 移植手術(shù)的方式

目前考慮2種神經(jīng)節(jié)細(xì)胞替代方式，即以分離的細(xì)胞懸浮液的形式移植或以預(yù)先形成的視網(wǎng)膜片狀移植。注射細(xì)胞懸液與片狀移植比較的優(yōu)勢(shì)在于：(1)可以精確地控制細(xì)胞移植的數(shù)量；(2)供體和宿主視網(wǎng)膜細(xì)胞形成更好的接觸；(3)手術(shù)微創(chuàng)，減少術(shù)后并發(fā)癥；(4)更容易標(biāo)記供體細(xì)胞。另一方面，高度退化的視網(wǎng)膜非常薄，并顯示出大量的膠質(zhì)瘢痕，因此視網(wǎng)膜薄片移植所需的更復(fù)雜的手術(shù)入路可能會(huì)增加瘢痕形成和纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。

全層視網(wǎng)膜薄片可以卷成套管，注入宿主視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙。大多數(shù)研究的主要目的是恢復(fù)光感受器功能[35]，但在此過(guò)程中也移植了RGC。然而，在貓和豬移植試驗(yàn)中，幾乎沒(méi)有觀察到供體與宿主視網(wǎng)膜組織的整合，這表明視網(wǎng)膜薄片可能不是實(shí)現(xiàn)RGC移植的有效途徑。

目前有研究團(tuán)隊(duì)沒(méi)有使用視網(wǎng)膜薄片進(jìn)行移植，而是提純了出生后的小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞，并將它們通過(guò)玻璃體內(nèi)注射的方式移植到成年嚙齒動(dòng)物視網(wǎng)膜上[36]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從較早期(胚胎或出生后早期)分離的RGC在移植后存活率較高。盡管RGC移植的成功率很低，但一些RGC移植到宿主視網(wǎng)膜的玻璃體內(nèi)，產(chǎn)生了內(nèi)源性RGC的正常形態(tài)，對(duì)光有反應(yīng)，甚至與外側(cè)膝狀體和視上丘建立了突觸聯(lián)系。

WANG等[37]將從胚胎干細(xì)胞(hESC)誘導(dǎo)分化出的視杯狀結(jié)構(gòu)中提取大約20 000個(gè)RPC移植到N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)處理的小鼠玻璃體腔中。觀察發(fā)現(xiàn)，其中約0.5%的細(xì)胞在移植后5周成功整合到NMDA處理的小鼠視網(wǎng)膜中。存活的移植細(xì)胞遍布整個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)，與宿主殘留的RGC在小鼠視網(wǎng)膜GCL內(nèi)呈互補(bǔ)分布。這些RGC投射到視神經(jīng)的能力表明，hESC來(lái)源的供體細(xì)胞可能具有整合到宿主視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)回路的能力。這些研究表明，hESC來(lái)源RGC移植是可能的，盡管效果不是很好。

8 小 結(jié)

在過(guò)去的研究中，hPSC已經(jīng)被用來(lái)探究不同類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育和各種神經(jīng)退行性疾病。但大多數(shù)的研究著眼于視網(wǎng)膜外層細(xì)胞的疾病，利用hPSC來(lái)研究RGC疾病的試驗(yàn)是缺乏的。目前運(yùn)用hPSC來(lái)治療RGC疾病還存在以下幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題需要解決：(1)移植細(xì)胞的手術(shù)方式選擇(以細(xì)胞懸液還是視網(wǎng)膜薄片)，并培養(yǎng)能夠掌握手術(shù)的臨床醫(yī)生；(2)從hPSC中區(qū)分出特定的亞型，正確理解不同視神經(jīng)疾病中特定RGC亞型的退變情況；(3)移植細(xì)胞分化和成熟程度；(4)疾病的最佳移植時(shí)期。另外，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，生物材料在移植中的運(yùn)用被重視起來(lái)。一些生物相容性好的、堅(jiān)固耐用的材料，如膠原、聚酯、聚環(huán)己內(nèi)酯、聚酰亞胺和對(duì)苯二烯等被用來(lái)避免移植損傷和免疫反應(yīng)。我們有理由相信，在不久的將來(lái)一些目前難以被治愈的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病在干細(xì)胞移植技術(shù)合理運(yùn)用下可得到突破性的進(jìn)展。