改性生物炭固定異養(yǎng)硝化菌對(duì)水中低濃度氨氮的去除*

王朝旭 任 靜

(1.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西省市政工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030600)

水體氮污染是我國(guó)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素之一。國(guó)家致力于降低水環(huán)境氨氮濃度，以緩解水體黑臭等環(huán)境問(wèn)題。目前，我國(guó)多地城鎮(zhèn)污水處理廠執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18918—2002)一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)和《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)Ⅴ類。因此，低濃度氨氮廢水處理成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，氨氮≤50 mg/L的廢水稱為低濃度氨氮廢水[1]。

針對(duì)低濃度氨氮廢水處理已有較多研究[2-3]。主要處理方法有化學(xué)沉淀法、離子交換法、折點(diǎn)加氯法、生物法和吸附法等。其中，生物法適用范圍廣、便于操作；吸附法工藝簡(jiǎn)單，且吸附劑種類多、成本低、多數(shù)能重復(fù)利用[4]。常用的吸附材料有沸石、膨潤(rùn)土、粉煤灰等。生物炭作為一種新型吸附材料，制備原料來(lái)源廣泛(如稻殼、玉米秸稈、牛糞、污泥等)，具有較大的比表面積，吸附能力強(qiáng)，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛[5-6]。

與吸附法相比，生物法效率較低；以生物炭為氨氮吸附材料，存在吸附飽和后的再生問(wèn)題。因此，采用生物炭基微生物固定化體(以下簡(jiǎn)寫為固定化體)，將生物炭的吸附性能與微生物的降解性能相結(jié)合，能更好去除水中氨氮[7]。另外，改性可提高生物炭的比表面積，增加生物炭表面官能團(tuán)數(shù)量，增強(qiáng)生物炭對(duì)氨氮的吸附去除能力[8-10]。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，改性核桃殼生物炭聯(lián)合施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)XL-2對(duì)氨氮的去除率高于純細(xì)菌和單獨(dú)生物炭吸附。然而，以改性生物炭為載體制備的固定化體，對(duì)低濃度氨氮廢水的處理效果如何，能否達(dá)標(biāo)排放，鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究從污水處理廠污泥中篩選一株異養(yǎng)硝化菌，分別以未改性稻殼生物炭(BC)、NaOH和H2O2改性BC為載體，用吸附法制備固定化體，開展生物炭和固定化體對(duì)水中低質(zhì)量濃度氨氮(約10 mg/L)的去除動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 異養(yǎng)硝化菌的分離與鑒定

1.1.1 富集、分離和純化

菌種來(lái)源為山西省晉中市某污水處理廠的濃縮池污泥。將2 mL污泥上清液接種至200 mL異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(氨氮初始質(zhì)量濃度10.00 mg/L)進(jìn)行富集培養(yǎng)(170 r/min、30 ℃)[12]，每3天按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量將培養(yǎng)基上清液再次接種至相同新鮮的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。然后，用平板涂布法和平板劃線法分離和純化，將分離的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，即得到異養(yǎng)硝化菌菌株[13]。

1.1.2 生物化學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

將分離純化的菌株接種至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(氨氮初始質(zhì)量濃度9.43 mg/L)，分別于0、12、16、24、48、72 h測(cè)定培養(yǎng)基中氨氮，再測(cè)定氨氮降解能力最強(qiáng)菌株培養(yǎng)體系中總氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。本研究共篩選3株菌(N1、N2、N3)，通過(guò)其氨氮降解能力鑒定細(xì)菌的生物化學(xué)活性，選取氨氮降解能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

采用與喬鑫[14]相同的方法，進(jìn)行所選取菌株的分子生物學(xué)鑒定。將菌株序列通過(guò)BLAST檢索，與GenBank中的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA-X軟件，以鄰接法構(gòu)建16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 固定化體的制備

1.2.1 生物炭

BC使用前過(guò)100目篩。分別用1 mol/L NaOH和10%(體積分?jǐn)?shù))H2O2制備改性BC，生物炭和改性液的比例始終為1 g∶50 mL[15]，改性時(shí)間均為12 h。將改性BC過(guò)濾，用去離子水淋洗至pH穩(wěn)定，并烘干。NaOH和H2O2改性后的BC分別記為NaOH-BC和H2O2-BC。

生物炭的pH采用pH計(jì)(Mettler Toledo Delta 320)測(cè)定(炭水比例1 g∶15 mL)；表面零電荷點(diǎn)(pHpzc)采用滴定法測(cè)定；電導(dǎo)率采用數(shù)顯電導(dǎo)率儀(雷磁DDS-307A)測(cè)定；酸堿性含氧官能團(tuán)數(shù)量采用Boehm滴定法測(cè)定。

1.2.2 固定化體

從斜面培養(yǎng)基上挑取篩選出的菌株接種于400 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至600 nm處吸光度(OD600)為1.0(170 r/min、25 ℃)，然后將培養(yǎng)基分裝至離心管中離心收集菌體，用無(wú)菌水洗滌兩次，最后懸于20 mL無(wú)菌水中，分別加入0.2 g BC、NaOH-BC或H2O2-BC，振蕩24 h(170 r/min、25 ℃)，過(guò)濾，并用無(wú)菌水淋洗，由此得到固定化體，分別記為BC+N3、NaOH-BC+N3或H2O2-BC+N3。采用磷脂法測(cè)定BC、NaOH-BC和H2O2-BC的微生物吸附量(以磷計(jì))，磷脂在所有微生物細(xì)胞中均存在，是細(xì)胞膜的主要成分，且在細(xì)胞死亡后很快分解，是表示活菌總數(shù)的理想指標(biāo)[16]。

1.3 生物炭和固定化體對(duì)水中氨氮的去除

為探究生物炭和固定化體對(duì)水中低濃度氨氮的去除效果，分別將0.2 g生物炭和固定化體加入20 mL模擬氨氮廢水(具體配置參考文獻(xiàn)[17])中。170 r/min、25 ℃下培養(yǎng)，定期采集水樣，0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定氨氮濃度。

為探究固定化體對(duì)水中氨氮去除的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，分別用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(見(jiàn)式(1))和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(見(jiàn)式(2))對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

Qt=Qe×(1-e-K1×t)

(1)

t/Qt=1/(K2×Qe2)+t/Qe

(2)

式中：t為時(shí)間，h；Qt為t時(shí)刻氨氮去除量，mg/g；Qe為平衡時(shí)氨氮去除量，mg/g；K1為準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，h-1；K2為準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，g/(mg·h)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算，使用Origin 8.5進(jìn)行繪圖和方程擬合，使用Statistics 22進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 異養(yǎng)硝化菌的篩選及對(duì)氨氮的降解

由圖1(a)計(jì)算可得，培養(yǎng)72 h，菌株N1、N2、N3對(duì)氨氮的降解率分別為52.65%、64.18%、72.02%，菌株N3比N1、N2更能有效降解氨氮。菌株N3對(duì)總氮的降解率為51.47%，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)明顯變化，均保持在較低水平，硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮最高分別為0.627、0.027 mg/L(見(jiàn)圖1(b))。選擇菌株N3為目標(biāo)菌株制備固定化體。

與GenBank中的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。該菌株與惡臭假單胞菌(DQ060242)、惡臭假單胞菌SNSK 589(MG584872)和惡臭假單胞菌(KC189961)的進(jìn)化距離較近，相似性分別為99.93%、99.86%和99.86%，從而確定菌株N3為惡臭假單胞菌，命名為惡臭假單胞菌N3(MN602471)。

2.2 改性對(duì)BC性質(zhì)的影響

由表1可見(jiàn)，與BC相比，NaOH-BC的pH和pHpzc分別增大1.76和1.61，微生物吸附量增加129.77 nmol/g；H2O2-BC的pH和pHpzc分別減小1.66和1.73，微生物吸附量減少86.52 nmol/g。除內(nèi)酯基外，改性前后BC各含氧官能團(tuán)指標(biāo)均顯著變化。

2.3 固定化體去除水中氨氮的過(guò)程

由圖3(a)可見(jiàn)，BC+N3和NaOH-BC+N3處理中，氨氮分別由最初的12.53、12.50 mg/L降至48 h時(shí)的1.39、1.37 mg/L，均低于GB 3838—2002中氨氮Ⅳ類限值(1.5 mg/L)；H2O2-BC+N3處理中，氨氮由最初的14.03 mg/L降至48 h時(shí)的2.76 mg/L，高于Ⅳ類限值。0～<12 h時(shí)，NaOH-BC+N3處理的氨氮明顯低于BC+N3，但12～48 h時(shí)兩個(gè)處理氨氮差別不大；0～<5、>12～48 h時(shí)，H2O2-BC+N3處理的氨氮總體高于BC+N3，5～12 h時(shí)明顯低于BC+N3。

圖1 氨氮降解過(guò)程中總氮、氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的變化Fig.1 Changes of total nitrogen，ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen during ammonia nitrogen degradation

圖2 菌株N3的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of strain N3

表1 改性前后BC的基本性質(zhì)1)

由圖3(b)可見(jiàn)，3種處理中，BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3處理的氨氮去除速率均在0～10 min快速增加到最大值，最大值分別為16.54、22.26、15.24 mg/(L·h)；10 min后迅速降低，5～48 h趨于平緩。

生物炭對(duì)氨氮的吸附在8 h達(dá)到平衡?？傮w上，培養(yǎng)初期，固定化體對(duì)氨氮的去除率低于生物炭，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，固定化體對(duì)氨氮的去除率逐漸升高，并最終高于生物炭處理。培養(yǎng)12 h，BC+N3的氨氮去除率(85.66%)高于BC(49.30%)；培養(yǎng)1 h，NaOH-BC+N3的氨氮去除率(45.09%)高于NaOH-BC(43.00%)；培養(yǎng)5 h，H2O2-BC+N3的氨氮去除率(59.91%)高于H2O2-BC(37.06%)。培養(yǎng)48 h，BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3對(duì)氨氮的去除率(88.94%、89.08%、79.00%)均高于相應(yīng)生物炭(8 h時(shí)BC、NaOH-BC和H2O2-BC分別為49.30%、53.51%和36.57%)；與改性前相比，改性固定化體更利于惡臭假單胞菌N3(MN602471)活性恢復(fù)與氨氮去除。

2.4 固定化體去除水中氨氮的動(dòng)力學(xué)擬合

各處理的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的R2均大于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)(見(jiàn)表2)；根據(jù)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算的Qe與實(shí)測(cè)值(BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3處理分別為1.11、1.11、1.13 mg/g)較接近。因此，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程能更好描述固定化體對(duì)氨氮的去除過(guò)程。NaOH-BC+N3處理的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程R2和K2均大于BC+N3、H2O2-BC+N3處理，表明NaOH改性固定化體對(duì)水中低濃度氨氮的去除能力最強(qiáng)，去除速率最大。

圖3 固定化體去除氨氮過(guò)程中氨氮質(zhì)量濃度和去除速率的變化Fig.3 Changes of ammonia nitrogen mass concentration and removal rate during the removal of ammonia nitrogen by biochar-based microbial immobilization body

表2 固定化體去除水中氨氮的動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)

3 討 論

3.1 生物炭性質(zhì)對(duì)固定化體去除氨氮的影響

與BC相比，NaOH-BC的pH顯著升高，主要原因?yàn)楦男赃^(guò)程中NaOH中和了生物炭表面較多的酸性含氧官能團(tuán)，使總酸性含氧官能團(tuán)顯著減少、總堿性含氧官能團(tuán)顯著增加；H2O2-BC的pH顯著降低，主要由于H2O2是一種強(qiáng)氧化性弱酸，可中和生物炭表面部分堿性含氧官能團(tuán)，并使總酸性含氧官能團(tuán)顯著增加、總堿性含氧官能團(tuán)顯著減少。

與BC相比，NaOH-BC的pHpzc顯著增大，H2O2-BC的pHpzc顯著減小，主要由于NaOH改性顯著減少了生物炭表面羧基數(shù)量(比BC減少7.90%)，而H2O2改性顯著增加了生物炭表面羧基數(shù)量(比BC增加12.61%)，同時(shí)酸性含氧官能團(tuán)是pHpzc的主控因素[18]。生物炭的pHpzc是影響生物炭微生物吸附量的重要指標(biāo)，主要由于其可改變生物炭和微生物之間的靜電引力。生物炭表面電荷的正負(fù)性與生物炭的pHpzc、溶液的pH有關(guān)[19]。NaOH-BC的pHpzc(8.74)大于模擬廢水pH(7.00)，故其表面帶正電荷，而大多數(shù)細(xì)菌的pHpzc(3～4)小于模擬廢水pH，故細(xì)菌表面帶負(fù)電荷，因此細(xì)菌在靜電引力作用下易附著在NaOH-BC上。然而，H2O2-BC的pHpzc(5.40)小于模擬廢水pH，故其表面帶負(fù)電荷，與帶負(fù)電荷的微生物之間的靜電斥力不利于吸附微生物。另外，H2O2-BC表面較多的酸性含氧官能團(tuán)對(duì)微生物活性有一定抑制作用[20]。因此，NaOH-BC的微生物吸附量顯著大于H2O2-BC。

3.2 固定化體去除氨氮的過(guò)程分析

固定化體去除氨氮的過(guò)程可分為氨氮迅速降低和趨于平緩兩個(gè)階段。在培養(yǎng)初期，生物炭吸附起主要作用，生物炭將氨氮吸附到其表面或孔隙中，氨氮濃度在短時(shí)間內(nèi)急劇降低；隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，微生物降解發(fā)揮作用，異養(yǎng)硝化菌與生物炭吸附的氨氮直接接觸，并利用廢水中的碳源降解氨氮，使氨氮濃度逐漸降低。吸附與降解的協(xié)同作用使廢水中的氨氮濃度達(dá)到平衡，這一過(guò)程符合WANG等[21]提出的固定化細(xì)菌吸附協(xié)同生物降解假說(shuō)模型。

BC+N3、NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3對(duì)氨氮的去除率分別在12、1、5 h后才分別高于相應(yīng)生物炭處理，表明與生物炭吸附相比，培養(yǎng)初期固定化體對(duì)氨氮的去除率較低，其原因可能為生物炭固定的惡臭假單胞菌N3對(duì)氨氮起降解作用需要一定的時(shí)間。固定化體的氨氮去除率(48 h)遠(yuǎn)高于生物炭吸附平衡時(shí)(8 h)的氨氮去除率，表明固定化體的吸附協(xié)同生物降解作用比生物炭的吸附作用更高效、徹底[22]。與BC+N3相比，NaOH-BC+N3和H2O2-BC+N3處理的氨氮去除率超過(guò)相應(yīng)生物炭處理所需時(shí)間較短，表明以改性生物炭為載體制備的固定化體更利于微生物發(fā)揮其降解作用，尤其是NaOH改性固定化體。其主要原因：(1)NaOH對(duì)生物炭有一定清洗作用，可清洗生物炭表面和孔隙中堵塞的灰分，增加生物炭比表面積，從而利于吸附固定微生物[23]。與BC和H2O2-BC相比，NaOH-BC的微生物吸附量最高(423.31 nmol/g)，而氨氧化微生物是氨氮去除的主要參與者[24]。(2)與BC和H2O2-BC相比，NaOH-BC的pH最高(9.74)，由于氨氧化過(guò)程會(huì)消耗堿度，投加NaOH-BC可補(bǔ)充水中堿度，進(jìn)而促進(jìn)氨氧化作用，提高氨氮去除率[25]。

固定化體對(duì)氨氮的去除過(guò)程更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)。固定化體對(duì)氨氮的去除由多個(gè)過(guò)程控制。生物炭表面豐富的官能團(tuán)和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)，對(duì)氨氮吸附均有貢獻(xiàn)。在氨氮從水相向生物炭遷移過(guò)程中，經(jīng)歷了水膜擴(kuò)散、生物炭顆粒表面擴(kuò)散和顆粒內(nèi)部微孔擴(kuò)散等多個(gè)過(guò)程；氨氮被生物炭吸附后，負(fù)載在生物炭上的微生物以氨氮為氮源，在酶促作用下將其分解[26]。

4 結(jié) 論

(1) 從污水處理廠濃縮池污泥中篩選一株異養(yǎng)硝化菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為惡臭假單胞菌，其對(duì)氨氮的72 h降解率為72.02%。

(2) 與BC相比，NaOH-BC的pH和pHpzc分別增大1.76和1.61，微生物吸附量增加129.77 nmol/g；H2O2-BC的pH和pHpzc分別減小1.66和1.73，微生物吸附量減少86.52 nmol/g。

(3) 培養(yǎng)48 h，固定化體對(duì)氨氮的去除率均高于相應(yīng)生物炭；與改性前相比，改性固定化體更利于惡臭假單胞菌N3(MN602471)活性恢復(fù)與氨氮去除。

(4) 固定化體的氨氮去除過(guò)程更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；NaOH-BC+N3對(duì)水中低濃度氨氮的去除能力優(yōu)于BC+N3和H2O2-BC+N3。